B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)Pristane誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究.pdf

1、B7-1（又稱CD80）分子是一種共刺激分子，主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）表面，其受體為T淋巴細(xì)胞表面CD28家族分子，二者結(jié)合后可介導(dǎo) T細(xì)胞活化、增殖與分化，從而發(fā)揮機(jī)體的免疫效應(yīng)。正常生理?xiàng)l件下B7-1分子表達(dá)穩(wěn)定，為T細(xì)胞的活化提供協(xié)同刺激信號(hào)，維持T細(xì)胞的存活。當(dāng)B7-1不表達(dá)或低表達(dá)的時(shí)候，將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的功能異常，致使T細(xì)胞無能或凋亡，導(dǎo)致機(jī)體患病。反之B7-1高表達(dá)又會(huì)

2、使T細(xì)胞過度活化，引起自身免疫性疾病。
　　自身免疫性疾?。╝utoimmune disease，AID）是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，主要表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞過度活化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的自身免疫病，其中狼瘡性腎炎又是SLE最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因之一。大量研究表明，在 SLE患者體內(nèi) B7-1

3、分子的表達(dá)明顯高于正常人，提示B7-1/CD28協(xié)同刺激信號(hào)在SLE病理過程中發(fā)揮著重要作用。
　　通過B7-1抗體封閉抗原提呈細(xì)胞表面的B7-1分子，從而阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路，降低機(jī)體的免疫應(yīng)答。但傳統(tǒng)的單克隆抗體由于鼠源性高，易引起人抗鼠抗體反應(yīng)（human anti-mouse antibody response，HAMA），限制了其應(yīng)用。采用基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)的嵌合抗體是一種人源化的重組抗體，它是應(yīng)用DNA重組技術(shù)

4、將鼠源性單抗V區(qū)基因與人IgG的C區(qū)基因拼接后，插入適當(dāng)載體，轉(zhuǎn)染相應(yīng)宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體分子。嵌合抗體包含了鼠源Fab段與人源Fc段，人源化部分達(dá)到70％，大大降低了HAMA反應(yīng)，延長了半衰期。此類抗體一方面具有鼠源性單抗 Fab段高親和力結(jié)合抗原的能力，另一方面其人源 Fc段在患者體內(nèi)又可介導(dǎo)ADCC效應(yīng)、CDC效應(yīng)及免疫調(diào)理作用。
　　本課題在運(yùn)用化學(xué)法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用自行研制的B7-1

5、人鼠嵌合抗體對(duì)模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，通過免疫學(xué)、血清學(xué)、病理學(xué)等指標(biāo)，探討B(tài)7-1人鼠嵌合抗體阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型病理損傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，以期尋找針對(duì)該類疾病更加高效、安全、給藥方便的抗體藥物。
　　一、B7-1人鼠嵌合抗體的制備及鑒定
　　目的：制備 B7-1人鼠嵌合抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　方法：將表達(dá)B7-1嵌合抗體的細(xì)胞株大規(guī)模培養(yǎng)，收集上清；Protein G親和層析分離純化抗

6、體；流式細(xì)胞術(shù)分析嵌合抗體對(duì)人及小鼠細(xì)胞膜型B7-1分子的識(shí)別。
　　結(jié)果：經(jīng)Protein G親和層析柱分析純化，Lowry法定量，所得的嵌合抗體蛋白濃度為2.5mg/L；B7-1人鼠嵌合抗體與轉(zhuǎn)人B7-1基因小鼠成纖維細(xì)胞株L929-B7-1、淋巴瘤細(xì)胞株Daudi、小鼠脾臟細(xì)胞的識(shí)別率分別為95.1%，96.6%和51.7%。
　　結(jié)論：B7-1人鼠嵌合抗體能夠特異性的識(shí)別細(xì)胞膜表面B7-1分子。
　　二、化學(xué)法

7、建立小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定
　　目的：在運(yùn)用化學(xué)法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型，并通過免疫學(xué)、血清學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。
　　方法：取6周齡雌性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為2組，模型組予一次性腹腔注射Pristane0.5ml/只，空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。每2周檢測(cè)一次血清中ANA及抗dsDNA抗體的滴度，每月定期檢測(cè)小鼠的尿蛋白含量，流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟中抗原提呈細(xì)胞、漿細(xì)胞、T細(xì)胞的活

8、化程度，經(jīng)HE染色觀察腎臟的病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)分析腎臟免疫復(fù)合物的沉積，透射電鏡觀察腎小球及基底膜的改變。
　　結(jié)果：Pristane誘導(dǎo)后，部分小鼠出現(xiàn)尿蛋白，隨時(shí)間的延長，4個(gè)月時(shí)80%小鼠尿蛋白含量達(dá)到++~+++；2個(gè)月時(shí)，小鼠血清中抗dsDNA抗體陽性率為60%，ANA陽性率為90%；流式分析結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟中吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞的活化明顯升高（P＜0.05），B細(xì)胞膜表面CD21、CD80、CD8

9、6分子表達(dá)水平造模組明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），模型組T細(xì)胞表面CD4、CD25、CD28、CD152分子表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；腎臟HE切片可見腎小球體積中重度增大，大量炎性細(xì)胞浸潤及腎小管輕微充血，免疫熒光染色可見腎小球上有大量IC沉積；透射電鏡觀察腎小球致密物沉積明顯，基底膜嚴(yán)重增厚。
　　結(jié)論：成功建立Pristane誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　三、B7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫

10、干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究
　　目的：探討B(tài)7-1人-鼠嵌合抗體阻斷B7/D28信號(hào)通路對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型病理損傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。
　　方法：按上述方法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型，取成模小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。抗體干預(yù)組用B7-1人-鼠嵌合抗體經(jīng)眼眶后靜脈給藥，陽性對(duì)照組注射免疫抑制劑 CTX，模型組注射人同型 IgG。每月定期檢測(cè)尿蛋白含量、血清中ANA及抗dsDNA抗體滴度，干預(yù)至3個(gè)月時(shí)，處死小鼠，研磨脾臟經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分

11、析多種免疫相關(guān)細(xì)胞的活化，取腎臟進(jìn)行HE染色分析，免疫復(fù)合物（IC）檢測(cè)及透射電鏡觀察。
　　結(jié)果：抗體干預(yù)后，尿蛋白濃度逐漸由++~+++降為±~++，同時(shí)血清中ANA和抗dsDNA抗體的熒光強(qiáng)度也明顯降低，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。流式結(jié)果顯示，抗體干預(yù)組脾臟中吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞的活化明顯低于模型組（P＜0.05），B細(xì)胞膜表面CD80、CD86分子表達(dá)水平模型組明顯高于抗體干預(yù)組（P＜0.05），

12、T細(xì)胞表面CD4、CD25、CD152分子表達(dá)情況模型組高于抗體干預(yù)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎臟HE染色結(jié)果顯示，抗體干預(yù)組腎小球炎性細(xì)胞侵潤及腎小管充血等表現(xiàn)均得到明顯改善。免疫熒光染色可見抗體干預(yù)組抗原抗體復(fù)合物（IC）的熒光強(qiáng)度明顯減弱。經(jīng)透射電鏡觀察，抗體干預(yù)組與模型組相比，腎小球上的電子致密物沉積減少，基底膜厚度趨于均勻。
　　結(jié)論：B7-1人鼠嵌合抗體通過抑制B7-1/CD28信號(hào)通路下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答，減少