大腸癌干細(xì)胞相關(guān)基因LYRM2的克隆、原核表達(dá)、抗體制備.pdf

1、LYRM2(LYR motif containing2)基因定位于人類第6號染色體的長臂15區(qū),在人類、猩猩、小鼠、犬、雞、大鼠和斑馬魚中高度保守。這個基因包含4種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,僅僅轉(zhuǎn)錄子1能翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白,其他三種均因缺少翻譯起始密碼而不能啟動翻譯過程。LYRM2基因編碼88個氨基酸,屬于LYR復(fù)合體1超家族,這個家族被認(rèn)為可能參與了真核細(xì)胞NADH復(fù)合體的組成,具體功能如何尚待研究。在我們的前期研究中,通過全基因組表達(dá)譜芯片比較結(jié)腸癌肝

2、轉(zhuǎn)移來源CD133+細(xì)胞與CD133-細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)LYRM2在CD133+細(xì)胞中高表達(dá)。CD133作為干細(xì)胞一種重要的表面標(biāo)記,已經(jīng)在各種實(shí)體瘤中被廣泛應(yīng)用。但是關(guān)于LYRM2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能方面尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步研究LYRM2基因及其蛋白在大腸癌干細(xì)胞中的作用,獲得該蛋白的抗體成為當(dāng)前的首要任務(wù)。本研究采用RT-PCR的方法從人腸癌細(xì)胞系SW480中克隆得到LYRM2基因的編碼序列(CDS Sequence),經(jīng)測序證實(shí)正確后,

3、將該段序列克隆入原核表達(dá)載體PET-43.1b中,誘導(dǎo)表達(dá)得到分子量約為72kDa融合蛋白。將該單克隆細(xì)菌株利用發(fā)酵工藝擴(kuò)增得到大量融合蛋白,之后利用腸激酶酶切和Ni柱分離純化目的蛋白,然后將獲得的純化蛋白免疫小鼠,獲得了單克隆抗體,為下一步研究LYRM2的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過克隆LYRM2基因編碼序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體并純化出LYRM2蛋白,制備單克隆抗體,而為下一步研究LYRM2基因及其蛋白在大腸癌干細(xì)胞中

4、的作用與調(diào)控機(jī)制提供重要的工具。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:1.從腸癌細(xì)胞系SW480提取總RNA,根據(jù)GeneBank(NM_020466.4)中的LYRM2 CDS設(shè)計(jì)引物,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出的編碼區(qū)序列,再通過基因重組技術(shù)將該基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-43.1b中、測序鑒定。2.測序正確后將重組后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,用異丙基硫代-β-D-半乳糖ITPG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,確定目的基因的表達(dá)情況后,利用發(fā)酵工藝進(jìn)一步大

5、量表達(dá),并經(jīng)Ni柱純化后獲得高純度的融合蛋白。3.將獲得的融合蛋白用腸激酶酶切和Ni柱分離純化目的蛋白之后免疫小鼠,將骨髓瘤細(xì)胞SP2／02Ag14與小鼠脾臟細(xì)胞融合,制備鼠的單克隆抗體,運(yùn)用ELISA和Western-blot檢測抗體測抗體特異性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:從人腸癌細(xì)胞系SW480提取總RNA,經(jīng)RT-PCR后,獲得一條約260bp的DNA電泳條帶,產(chǎn)物與pET-43.1b載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌后得到陽性克隆,經(jīng)BLA

6、ST分析證實(shí)與LYRM2基因的CDS(NM020466.4)序列完全一致。將載有目的片段的pET-43.1b重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌,誘導(dǎo)表達(dá)得到分子量約為72kDa融合蛋白。利用發(fā)酵工藝進(jìn)一步大量表達(dá)融合蛋白,并經(jīng)Ni柱純化后獲得高純度的融合蛋白。將融合蛋白用腸激酶酶切和Ni柱分離得到一大小為15kDa的LYRM2蛋白,用該蛋白免疫Bal-B／C nu／nu,并將骨髓瘤細(xì)胞SP2／02Ag14與小鼠脾臟細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞,制備鼠的