人BTLA的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及其在肺癌和結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的研究.pdf

1、B、T淋巴細(xì)胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是2003年發(fā)現(xiàn)的CD28家族共抑制受體，主要表達(dá)于T、B細(xì)胞，在DC、單核細(xì)胞及NK細(xì)胞上也有表達(dá)，能負(fù)性調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的激活與增殖，維持樹(shù)突狀細(xì)胞在內(nèi)環(huán)境中的穩(wěn)定，抑制記憶性CD8+T細(xì)胞的分化，其在腫瘤患者體內(nèi)T細(xì)胞上高表達(dá)，提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步研究BTLA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，我們擬構(gòu)建人BTLA(hBTLA)

2、原核表達(dá)載體和表達(dá)蛋白并制備多克隆抗體，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)肺癌和結(jié)直腸癌組織中BTLA蛋白的表達(dá)，并分析其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 [目的]
　　 構(gòu)建BTLA原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)hBTLA融合蛋白，并經(jīng)親和層析法純化，將其作為抗原免疫家兔，制備兔抗hBTLA多克隆抗體，純化抗體后，在蛋白水平檢測(cè)該分子在肺癌和結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，并分析BTLA基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 [方法

3、]
　　 1.構(gòu)建含hBTLA胞外區(qū)目的基因的T載體克隆及原核細(xì)胞表達(dá)載體亞克隆，并經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序證實(shí)。IPFG誘導(dǎo)表達(dá)hBTLA融合蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定，將重組基因工程菌擴(kuò)大誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化誘導(dǎo)的蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏完全佐劑乳化，將其作為抗原免疫家兔，獲得兔抗人免疫血清，經(jīng)硫酸銨鹽析純化，獲得初步純化的兔抗hBTLA多克隆抗體，通過(guò)雙擴(kuò)散試驗(yàn)和間接ELISA法檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)和

4、純度，western blot及免疫組化方法初步鑒定其活性。
　　 3.收集手術(shù)切除的肺癌和結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BTLA蛋白在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，并分析其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　 4.用商品多抗和自制多抗建立ELISA夾心法，并對(duì)方法進(jìn)行條件優(yōu)化，測(cè)定其準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和線性范圍，方法建立后可用于檢測(cè)血清中可溶性BTLA的含量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.獲得hBTL

5、A胞外區(qū)重組基因工程菌的克隆，并表達(dá)具有抗原性的BTLA融合蛋白。
　　 2.獲得純化的hBTLA融合蛋白，并用其免疫家兔，得到兔抗hBTLA多克隆抗體。以重組蛋白為抗原，用間接ELISA檢測(cè)抗hBTLA抗血清的效價(jià)達(dá)到1:20000。雙向瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)顯示抗hBTLA多克隆抗體與抗原之間形成單一沉淀線，效價(jià)達(dá)到1:16，表明所制備的多抗效價(jià)較高，并具有良好的純度。
　　 3.免疫印跡分析抗hBTLA抗血清在分子量約1

6、5.72KDa處與相應(yīng)的原核表達(dá)蛋白呈現(xiàn)特異性結(jié)合條帶，表明所制備的多克隆抗體具有較好的免疫學(xué)活性。免疫組織化學(xué)染色證明抗體能與腫瘤組織中天然表達(dá)的hBTLA蛋白特異性結(jié)合，與商品單抗檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 4.22例肺癌標(biāo)本和19例結(jié)直腸癌標(biāo)本的免疫組化檢測(cè)中，BTLA表達(dá)的陽(yáng)性率分別為32％和100％，表達(dá)部位位于胞漿和胞膜區(qū)，在肺癌和結(jié)直腸癌組織中均有表達(dá)，但結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯強(qiáng)于肺癌組織中的表達(dá)。
　　 [結(jié)

7、論]
　　 成功構(gòu)建了高效表達(dá)重組hBTLA蛋白的原核表達(dá)載體，獲得高效穩(wěn)定的重組基因工程大腸桿菌表達(dá)菌株，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的hBTLA融合蛋白具有免疫原性，將其作為免疫原制備的兔抗hBTLA多克隆抗體能與純化的外源性hBTLA融合蛋白和天然表達(dá)的內(nèi)源性BTLA蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，檢測(cè)抗hBTLA多克隆抗體效價(jià)、純度、活性均達(dá)到預(yù)期要求。檢測(cè)BTLA在蛋白質(zhì)水平表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BTLA在肺癌和結(jié)直腸癌組織中均有表達(dá)，但結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯