冬凌草甲素聯(lián)合柔紅霉素對jurkat細胞的增殖抑制作用及其機制的研究.pdf

1、目的；冬凌草甲素(Oridonin)是一種從冬凌草植物(Rabdosa rubescens)中提取出來的具有生物學活性的四環(huán)二帖類化合物，研究發(fā)現(xiàn)它具有抗炎、抗菌和抗腫瘤的功效，冬凌草甲素對多種腫瘤細胞有不同程度的抑制作用，但對急性T淋巴細胞白血病的研究鮮有報道，本實驗采用急性T淋巴細胞白血病jurkat細胞作為體外實驗研究的對象，探討冬凌草甲素(oridonin)單用及聯(lián)合柔紅霉素(DNR)對jurkat細胞的增殖抑制、促凋亡作用并對

2、冬凌草甲素誘導jurkat細胞凋亡機制的研究進行初步的探討，為臨床治療急性T淋巴細胞白血病的新藥開發(fā)利用提供一定的實驗依據(jù)。
　　 方法：采用CCK-8檢測冬凌草甲素單用及聯(lián)合化療藥物柔紅霉素作用于jurkat細胞24h、48h、72h后的增殖抑制作用；利用相差顯微鏡、Giemsa染色、羅丹明123熒光染色觀察冬凌草甲素作用于jurkat細胞48h后的形態(tài)學變化；AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測冬凌草甲素單用及聯(lián)合化療

3、藥物柔紅霉素作用于jurkat細胞48h后凋亡的影響；為進一步明確冬凌草甲素誘導jurkat細胞凋亡的部分作用機制，在第二部分實驗中采用流式細胞儀檢測冬凌草甲素作用于jurkat細胞48h后的周期分布變化；羅丹明123檢測冬凌草甲素作用于jurkat細胞48h后的熒光強度；caspase-3酶活性檢測冬凌草甲素作用于jurkat細胞48h后的caspase-3酶活性變化。
　　 結(jié)果：⑴CCK-8試劑盒檢測表明相同時間下，隨著藥

4、物濃度的增加，吸光度值逐漸降低；相同藥物濃度下，隨著作用時間的延長，吸光度值逐漸減低，表明冬凌草甲素對jurkat細胞的作用呈現(xiàn)一定的劑量-時間依賴性。取對jurkat細胞抑制作用最弱的1ug/ml柔紅霉素聯(lián)合不同濃度的冬凌草甲素共同作用于jurkat細胞，其抑制作用高于單用柔紅霉素及冬凌草甲素，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，金氏公式判斷冬凌草甲素聯(lián)合柔紅霉素對jurkat細胞具有協(xié)同抑制效應。⑵相差顯微鏡下，隨著藥物濃度的增加

5、，細胞密度逐漸減低，邊緣不清，亮度逐漸減弱，呈現(xiàn)膜皺縮、核破裂等溶解性壞死等變化；Giemsa染色觀察空白對照組細胞邊緣光滑，染色質(zhì)紫紅色，伴隨藥物濃度的增加，胞膜皺縮，細胞核邊集，空泡變性、染色質(zhì)密集濃染，部分觀察到凋亡小體等凋亡形態(tài)學變化；羅丹明123染色觀察隨著藥物濃度的增加，jurkat細胞呈現(xiàn)胞體萎縮，細胞熒光染色強度減弱等表現(xiàn)。⑶流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：不同濃度的冬凌草甲素(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/

6、ml、16μg/ml)處理組作用于jurkat細胞48h后的凋亡率分別為7.74±0.96％、13.26±1.49％、17.42±1.24％、25.13±2.12％、29.07±0.59％，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，柔紅霉素最低誘導凋亡濃度(0.04μg/ml)聯(lián)合接近IC50濃度的冬凌草甲素(4μg/ml)共同作用于jurkat細胞48h，其凋亡率明顯高于單用柔紅霉素、冬凌草甲素的凋亡率，差異具有統(tǒng)計學意義。⑷流式細胞儀檢測

7、表明：不同濃度的冬凌草甲素(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)處理組作用于jurkat細胞48h后，隨著藥物濃度的增加，G1期細胞比例分別為33.96±1.15％、36.04±0.30％、37.05±0.18％、37.59±0.76％、38.77±1.58％、47.71±4.94％，其中8μg/ml、16μg/ml冬凌草甲素處理組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；S期細胞呈減少趨

8、勢，各濃度處理組與空白對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗表明冬凌草甲素影響細胞周期分布，可誘導jurkat細胞阻滯于G1期。⑸FCM檢測表明：隨著藥物濃度的增加，熒光強度呈濃度依賴性降低，各濃度處理組的熒光強度分別為3806.79±186.30、3516.43±223.86、3072.41±28.52、665.82±85.39、193.08±3.70，與空白對照組相比，除第一處理組外，差異具有統(tǒng)計學意義(F=302.

9、584，P<0.05)，實驗表明冬凌草甲素可誘導jurkat細胞膜電位降低，是冬凌草甲素誘導jurkat細胞凋亡的機制之一。⑹不同濃度的冬凌草甲素(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml)處理組作用于jurkat細胞48h后，隨著藥物濃度的增加，吸光度值分別為0.162±0.005、0.169±0.004、0.179±0.015、0.190±0.008、0.203±0.155與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計

10、學意義。實驗表明隨著藥物濃度增加吸光度值呈現(xiàn)濃度依賴性增加，間接反映caspase-3酶活性逐漸增高。
　　 結(jié)論：①冬凌草甲素對iurkat細胞具有增殖抑制作用，該作用具有一定的時間-劑量依賴性；當冬凌草甲素聯(lián)合化療藥物柔紅霉素時對jurkat細胞具有協(xié)同抑制作用，提示冬凌草甲素本身可作為一種新型抗腫瘤藥物在抑制白血病細胞生長、誘導其凋亡的同時，還可以作為化療藥物的輔助用藥，增強化療藥物對白血病細胞的敏感性、降低用藥量及其副作

11、用。②冬凌草甲素對jurkat細胞的殺傷作用主要是通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)的，其機制主要如下：影響細胞周期分布，將細胞阻滯于G1期，周期阻滯作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，從而有效控制細胞增殖；線粒體跨膜電位(△Ψm)的降低呈一定的劑量依賴性，其降低程度反映線粒體膜受損的程度，是細胞凋亡的早期事件，反映細胞進入不可逆的凋亡程序；Caspase-3是caspase蛋白家族執(zhí)行細胞凋亡的最強大凋亡效應因子及最終凋亡執(zhí)行者，激活caspase-3酶活性