2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  腹膜纖維化迄今仍然是一個世界性的難題,是導(dǎo)致尿毒癥患者被迫中斷長期腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)的最主要因素,目前尚無有效的治療方法。在非生理性腹膜透析液的長期刺激下,就會導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生,其重要機理是腹膜間皮細(xì)胞從上皮細(xì)胞表型向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)過程的發(fā)生,由此啟動細(xì)胞增殖和膠原等基質(zhì)的積聚

2、等,主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及到TGF-β-Smad通路、PI3-K/Akt/mTOR途徑等。雷帕霉素(rapamycin),通過與FK結(jié)合蛋白(FK-binding protein,F(xiàn)KBP)結(jié)合,抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性,進(jìn)而抑制細(xì)胞生長與增殖。在腎、肝、心等多個臟器領(lǐng)域的研究中雷帕霉素在抗增殖和抗纖維化方面已經(jīng)顯示了重要作用。而雷帕霉素在防治腹膜纖維化方面的報道

3、非常少且機制仍未闡明。
  Rho GTPases作為Ras超家族的一個亞族,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)控了大量如細(xì)胞極化、細(xì)胞的黏附及遷移、分化、增殖等的細(xì)胞活動。其中研究的最多的三個成員是RhoA、Rac1和Cdc42。研究表明,Rho GTPases在EMT過程中起到了至關(guān)重要的作用。此外,研究證實,mTOR與Rho GTPases之間的信號交互作用,參與介導(dǎo)了多種細(xì)胞EMT及纖維化病變的發(fā)生過程;而雷帕霉素通過阻

4、斷mTOR的表達(dá)抑制部分Rho GTPase的活性,進(jìn)而抑制EMT。目前mTOR與Rho GTPases在腹膜纖維化中作用的研究尚未見報道?;谝陨戏治觯覀冋J(rèn)為雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)Rho GTPases的活性抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化的過程。為此,本研究開展如下。
  第一部分 雷帕霉素有效抑制腹膜透析大鼠腹膜纖維化
  研究目的:
  明確雷帕霉素對于腹膜透析模型大鼠腹膜纖維化的防治效果
  實驗方

5、法:
  取45只正常SD大鼠,隨機分為5組:正常組,生理鹽水組,高糖組,低濃度雷帕治療組,高濃度雷帕治療組,處理6周后處死,評估腹膜功能,取腹膜組織,行HE染色及α-肌動蛋白(smooth muscle actin-alpha,α-SMA)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的免疫組化染色,分析各組腹膜纖維化情況, Western Blot及realtime PCR檢測α

6、-SMA、TGF-β1的表達(dá)變化。
  結(jié)果:
  高糖組大鼠的腹膜功能相較正常組及生理鹽水組明顯下降,低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜功能; HE染色顯示,高糖組呈現(xiàn)腹膜纖維化狀態(tài),腹膜厚度明顯增加,低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜纖維化狀態(tài),且呈濃度相關(guān)性。免疫組化、Western Blot及realtime PCR顯示,高塘組α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)較對照組明顯升高,雷帕組表達(dá)明顯下降,且呈濃

7、度相關(guān)性。
  結(jié)論:
  通過動物層面驗證了雷帕霉素對腹膜纖維化有明顯的防治作用,在有效濃度范圍內(nèi),其防治效果與劑量呈一定的正相關(guān)。雷帕霉素減少TGF-β的分泌,抑制成纖維細(xì)胞的形成,抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成。
  第二部分 雷帕霉素抑制高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT的研究
  研究目的:
  明確雷帕霉素對于腹膜間皮細(xì)胞EMT的抑制作用
  實驗方法:
  取正常SD大鼠腹膜,原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞,

8、取第3-4代細(xì)胞,予以不同濃度高糖(30,60,120mM)干預(yù),及不同濃度雷帕霉素(10,100nM)干預(yù)一定時間,通過Western Blot檢測細(xì)胞中α-SMA及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá),通過realtime PCR檢測α-SMA、纖維連接蛋白(Fibronectin)及膠原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ)的表達(dá);細(xì)胞劃痕實驗及Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化。
  結(jié)果:
  高糖處理后,

9、α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ的表達(dá)量相較正常組明顯升高,E-cadherin的表達(dá)量明顯下降,細(xì)胞遷移能力明顯增加。與高塘組相比,雷帕霉素使α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ的表達(dá)明顯下降,E-cadherin的表達(dá)明顯升高,細(xì)胞遷移能力明顯下降,且呈濃度相關(guān)性。
  結(jié)論:
  高糖處理后腹膜間皮細(xì)胞呈現(xiàn)EMT改變,雷帕霉素有效抑制高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT。
  第三

10、部分 雷帕霉素通過抑制Rho GTPases的活性逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞EMT
  研究目的:
  探索雷帕霉素抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT的具體作用機制
  實驗方法:
  取原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞,予以不同濃度高糖(30,60,120mM)干預(yù),及不同濃度雷帕霉素(10,100nM)干預(yù)一定時間,通過Western Blot檢測細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-4,5-bisphosph

11、ate3-kinase,PI3K)的、p-PI3K、蛋白激酶B(PKB或Akt)、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達(dá);通過pull down方法檢測GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白的表達(dá);通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察細(xì)胞骨架的變化情況。
  結(jié)果:
  高糖處理后,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)量相較正常組明顯升高,雷帕霉素明顯減少p-mTOR的表達(dá)量;Pull down實驗顯示,R

12、hoA、Rac1及Cdc42的GTP活化水平在高糖刺激后明顯升高,雷帕霉素使三者的GTP水平明顯下降;細(xì)胞免疫熒光實驗顯示,正常的腹膜間皮細(xì)胞呈現(xiàn)少量的應(yīng)力纖維(stress fiber)、粘著斑(focal adhesion)、板狀偽足(lamellipodia)、絲狀偽足(filopodia),高糖刺激使得腹膜間皮細(xì)胞形成更多的stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia,而雷

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