雷帕霉素對腹膜纖維化的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究背景:
　　腹膜纖維化迄今仍然是一個世界性的難題，是導(dǎo)致尿毒癥患者被迫中斷長期腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)的最主要因素，目前尚無有效的治療方法。在非生理性腹膜透析液的長期刺激下，就會導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生，其重要機理是腹膜間皮細(xì)胞從上皮細(xì)胞表型向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)過程的發(fā)生，由此啟動細(xì)胞增殖和膠原等基質(zhì)的積聚

2、等，主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及到TGF-β-Smad通路、PI3-K/Akt/mTOR途徑等。雷帕霉素（rapamycin），通過與FK結(jié)合蛋白(FK-binding protein，F(xiàn)KBP)結(jié)合，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長與增殖。在腎、肝、心等多個臟器領(lǐng)域的研究中雷帕霉素在抗增殖和抗纖維化方面已經(jīng)顯示了重要作用。而雷帕霉素在防治腹膜纖維化方面的報道

3、非常少且機制仍未闡明。
　　Rho GTPases作為Ras超家族的一個亞族，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重構(gòu)及基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控了大量如細(xì)胞極化、細(xì)胞的黏附及遷移、分化、增殖等的細(xì)胞活動。其中研究的最多的三個成員是RhoA、Rac1和Cdc42。研究表明，Rho GTPases在EMT過程中起到了至關(guān)重要的作用。此外，研究證實，mTOR與Rho GTPases之間的信號交互作用，參與介導(dǎo)了多種細(xì)胞EMT及纖維化病變的發(fā)生過程;而雷帕霉素通過阻

4、斷mTOR的表達(dá)抑制部分Rho GTPase的活性，進(jìn)而抑制EMT。目前mTOR與Rho GTPases在腹膜纖維化中作用的研究尚未見報道?；谝陨戏治觯覀冋J(rèn)為雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)Rho GTPases的活性抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化的過程。為此，本研究開展如下。
　　第一部分 雷帕霉素有效抑制腹膜透析大鼠腹膜纖維化
　　研究目的:
　　明確雷帕霉素對于腹膜透析模型大鼠腹膜纖維化的防治效果
　　實驗方

5、法:
　　取45只正常SD大鼠，隨機分為5組:正常組，生理鹽水組，高糖組，低濃度雷帕治療組，高濃度雷帕治療組，處理6周后處死，評估腹膜功能，取腹膜組織，行HE染色及α-肌動蛋白(smooth muscle actin-alpha,α-SMA)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)的免疫組化染色，分析各組腹膜纖維化情況， Western Blot及realtime PCR檢測α

6、-SMA、TGF-β1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　高糖組大鼠的腹膜功能相較正常組及生理鹽水組明顯下降，低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜功能; HE染色顯示，高糖組呈現(xiàn)腹膜纖維化狀態(tài)，腹膜厚度明顯增加，低濃度雷帕及高濃度雷帕均顯著改善腹膜纖維化狀態(tài)，且呈濃度相關(guān)性。免疫組化、Western Blot及realtime PCR顯示，高塘組α-SMA、TGF-β1蛋白及mRNA表達(dá)較對照組明顯升高，雷帕組表達(dá)明顯下降，且呈濃

7、度相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　通過動物層面驗證了雷帕霉素對腹膜纖維化有明顯的防治作用，在有效濃度范圍內(nèi)，其防治效果與劑量呈一定的正相關(guān)。雷帕霉素減少TGF-β的分泌，抑制成纖維細(xì)胞的形成，抑制細(xì)胞外基質(zhì)形成。
　　第二部分 雷帕霉素抑制高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞EMT的研究
　　研究目的:
　　明確雷帕霉素對于腹膜間皮細(xì)胞EMT的抑制作用
　　實驗方法:
　　取正常SD大鼠腹膜，原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞，

8、取第3-4代細(xì)胞，予以不同濃度高糖(30，60，120mM)干預(yù)，及不同濃度雷帕霉素(10，100nM)干預(yù)一定時間，通過Western Blot檢測細(xì)胞中α-SMA及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá)，通過realtime PCR檢測α-SMA、纖維連接蛋白（Fibronectin）及膠原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ)的表達(dá);細(xì)胞劃痕實驗及Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力的變化。
　　結(jié)果:
　　高糖處理后，

9、α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ的表達(dá)量相較正常組明顯升高，E-cadherin的表達(dá)量明顯下降，細(xì)胞遷移能力明顯增加。與高塘組相比，雷帕霉素使α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ的表達(dá)明顯下降，E-cadherin的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞遷移能力明顯下降，且呈濃度相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　高糖處理后腹膜間皮細(xì)胞呈現(xiàn)EMT改變，雷帕霉素有效抑制高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT。
　　第三

10、部分 雷帕霉素通過抑制Rho GTPases的活性逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞EMT
　　研究目的:
　　探索雷帕霉素抑制腹膜間皮細(xì)胞EMT的具體作用機制
　　實驗方法:
　　取原代培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞，予以不同濃度高糖(30，60，120mM)干預(yù)，及不同濃度雷帕霉素(10，100nM)干預(yù)一定時間，通過Western Blot檢測細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol-4，5-bisphosph

11、ate3-kinase，PI3K）的、p-PI3K、蛋白激酶B（PKB或Akt）、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達(dá);通過pull down方法檢測GTP-RhoA、GTP-Rac1、GTP-Cdc42蛋白的表達(dá);通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察細(xì)胞骨架的變化情況。
　　結(jié)果:
　　高糖處理后，p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表達(dá)量相較正常組明顯升高，雷帕霉素明顯減少p-mTOR的表達(dá)量;Pull down實驗顯示，R

12、hoA、Rac1及Cdc42的GTP活化水平在高糖刺激后明顯升高，雷帕霉素使三者的GTP水平明顯下降;細(xì)胞免疫熒光實驗顯示，正常的腹膜間皮細(xì)胞呈現(xiàn)少量的應(yīng)力纖維（stress fiber）、粘著斑(focal adhesion)、板狀偽足（lamellipodia）、絲狀偽足(filopodia)，高糖刺激使得腹膜間皮細(xì)胞形成更多的stress fiber、focal adhesion、lamellipodia、filopodia，而雷