褪黑素增強阿霉素對HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用及其機制研究.pdf

1、背景：肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率為30.3/10萬，占所有癌癥的13.13％，居第3位，近二十年來，死亡率增加了41.7％，約占全世界HCC死亡人數(shù)的42％。近年來，由于丙型肝炎病毒感染增加，肝癌的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家也有上升的趨勢。目前，手術(shù)切除仍是治療HCC的最佳手段。但是80％的患者在診斷時已屬晚期，失去手術(shù)機會，而對于那些手術(shù)患者，其兩年內(nèi)的復(fù)發(fā)率也高達(dá)

2、50％?；熓悄[瘤治療的重要手段，但對肝癌的療效尚令人失望。作為肝癌治療最常見的藥物——阿霉素（Doxorubicin，Dox）其有效率也僅為4％～10.5％，并且其毒副反應(yīng)又進一步限制了其臨床應(yīng)用。目前，諸多醫(yī)家開始對中草藥及人體內(nèi)部本身所存在的抗腫瘤物質(zhì)進行了深入的探討和研究，褪黑素就是其中之一。褪黑素（melatonin，Mel）主要是松果體分泌的一種吲哚胺類激素，化學(xué)成分為N-乙酰-5-甲氧基色胺，是一種重要的生理性腫瘤抑制劑，

3、具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。其分泌量有明顯的晝夜節(jié)律，有利于睡眠，還可以抑制腫瘤細(xì)胞生長，增強人體免疫系統(tǒng)的功能。褪黑素作為機體內(nèi)的一種天然抑瘤因素物質(zhì)越來越受到重視。動物實驗表明，Mel能顯著抑制小鼠移植性肝癌的生長，并能抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究選用肝癌HepG2細(xì)胞株作為實驗對象，觀察Mel聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，探討其可能的作用機制，以期為肝癌的臨床治療提供新的方法。
　　 目的：探討褪黑素聯(lián)合阿霉素對HepG

4、2細(xì)胞株的增殖抑制作用及其對Bax，Caspase-3，Bcl-2表達(dá)的影響。
　　 方法：采用MTT法測定Mel聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)胞的增殖抑制情況；原位細(xì)胞凋亡檢測法（Terminal deoxynucleotidy transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀（Flow Cytomtry，F(xiàn)CM）檢測凋亡率；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測B

5、ax，Caspase-3，Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。
　　 1、Mel聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用
　　 采用MTT法，分別觀察了Mel和Dox單獨以及Mel聯(lián)合Dox對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示：(1)Mel（10-8～10-5mmol/L）對HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用，呈明顯的劑量和時間依賴性。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析：r=0.993，P＜0.01；IC50為7.623×10-5

6、；（2）Dox（0.31～2.5mg/L）對HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用，呈劑量依賴性。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析：r=0.9231，P＜0.01；IC50為0.56mg/L；（3）不同濃度的Mel（10-8、10-7、10-6、10-5mmol/L）分別與系列濃度Dox(0.31～2.5mg/L)聯(lián)合對HepG2細(xì)胞有增殖抑制作用。采用CDI分析兩藥相互作用性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在合適的劑量下，Mel與Dox有協(xié)同作用（CDI＜1

7、）。
　　 2、Mel與Dox聯(lián)合對人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡影響
　　 采用末端雙脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口標(biāo)記技術(shù)（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）觀察HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征包括核固縮、體積縮小、核染色質(zhì)邊集等。研究發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞增殖旺盛，可見少許凋亡細(xì)胞；藥

8、物作用上述細(xì)胞48h后，細(xì)胞密度明顯減少，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，以聯(lián)合用藥組最顯著。
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞凋亡率。在DNA圖譜G0/G1期前出現(xiàn)了一個代表細(xì)胞凋亡的亞G1峰即凋亡峰。FCM結(jié)果顯示，正常對照組可見低矮的凋亡峰，藥物處理48h后，其凋亡峰增加，以聯(lián)合用藥組最為顯著，提示兩藥合用有協(xié)同誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡作用。
　　 3、Mel聯(lián)合Dox誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2

9、凋亡的可能分子機制
　　 采用細(xì)胞免疫組化法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)情況。結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞中，Bcl-2、Bax和Caspase-3均有不同程度表達(dá)。藥物處理后HepG2細(xì)胞Bcl-2表達(dá)降低，而Bax和Caspase-3表達(dá)增加，以聯(lián)合用藥組最為顯著。
　　 結(jié)論：本結(jié)果表明一定濃度的Mel能增強Dox對HepG2細(xì)胞株的增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機制可能與上調(diào)Bax、Caspase-