紫草素對A549細胞抑制作用及阿霉素腫瘤抑制效應影響的機制探討.pdf

1、研究背景：
　　新近的流行病學資料表明，肺癌已經(jīng)成為惡性腫瘤的首位，嚴重危害人類的健康。其中80-85%為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)，包括腺癌、鱗癌、大細胞癌等。盡管肺癌的治療手段不斷進步，肺癌的生存率仍然很低?；?、放療仍是目前治療這些患者的常用手段。腫瘤耐藥是當前化療的一個主要問題，其中涉及許多因素，包括抗癌藥物的效力、腫瘤細胞對藥物反應、腫瘤細胞微環(huán)境、腫瘤細胞的異質(zhì)性等

2、。因此，尋找高效低毒的抗癌藥物成為近年來腫瘤基礎和臨床研究的熱點。在NSCLC患者治療中，阿霉素作為一種治療藥物，在一些難治性病例中曾被選用。然而，隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，新型化療藥物的研制，在肺癌的治療方面，阿霉素逐漸被遺忘。同時，由于兩方面的因素限制了阿霉素的臨床應用，一方面由于其骨髓抑制、心肌損傷和心肌毒性等毒副作用；另一方面，阿霉素的耐藥性是一個重要的因素。正如許多傳統(tǒng)抗癌藥物一樣，如何克服阿霉素的毒副作用和耐藥性是臨床學者需要迫切

3、解決的難題。關于阿霉素的研究也從未終止。
　　近年來，中草藥的抗癌作用越來越引起人們的關注。中草藥是祖國醫(yī)學防治疾病的有力武器，人們發(fā)現(xiàn)中藥治療惡性腫瘤，在提高化療效果、改善生存質(zhì)量、減輕臨床癥狀等方面都有很好的效果。已有研究證實，部分中藥與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應用表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，能夠有效緩解晚期NSCLC患者癥狀，減少不良反應，改善病人生活質(zhì)量。紫草素是從中藥紫草的根部提取得到的一種萘醌類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，其對肝癌、乳腺癌等多種腫

4、瘤細胞均有抑制作用。關于紫草素在NSCLC方面的抗癌作用及其涉及的具體機制尚未完全闡明。
　　目的：
　　觀察紫草素對A549細胞的增殖抑制作用以及與阿霉素聯(lián)用后對A549細胞凋亡、細胞周期、侵襲、遷移的影響。探討紫草素聯(lián)合阿霉素對肺癌A549細胞抗腫瘤作用的機制。
　　方法：
　　1.噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測不同藥物處理的肺癌A549細胞抑制率。

5、>　　2. Transwell法檢測A549細胞侵襲數(shù)。
　　3.細胞劃痕實驗檢測A549細胞遷移率。
　　4.集落克隆法檢測A549細胞的增殖。
　　5. PI染色檢測細胞凋亡。
　　6.流式細胞儀檢測細胞周期。
　　7.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、

6、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達。
　　8.二甲基亞砜(Dihydroethidium,DHE)熒光探針檢測藥物對 A549細胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影響。
　　9.腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)檢測試劑盒檢測細胞內(nèi) ATP水平變化。
　　10.熒光顯微鏡下觀察線粒體膜勢能變化。
　　11.流式細胞儀測定A549細胞內(nèi)阿霉素濃度。

7、
　　12.活細胞工作站觀察細胞內(nèi)阿霉素熒光強度。
　　13. Westem-blot檢測ABC轉(zhuǎn)運相關蛋白的表達。
　　結果：
　　1.0.8μmol/L以上濃度的紫草素對A549細胞顯示出較強的抑制作用，因此我們選擇0.8μmol/L作為后續(xù)實驗的藥物起始濃度。
　　2.0.8μmol/L以上濃度紫草素作用于A549細胞48h以后，細胞數(shù)量明顯減少，細胞間距增大，胞體變圓、縮小，出現(xiàn)明顯的細胞凋亡現(xiàn)象。

8、
　　3.與對照組比較，不同濃度紫草素處理組 A549細胞侵襲數(shù)目、遷移率降低，存在統(tǒng)計學差異。與對照組及單用藥物組相比，紫草素聯(lián)合阿霉素組侵襲細胞數(shù)目、遷移率顯著減低。與對照組比較，各組MMP-2、MMP-9表達水平均下調(diào)，其中紫草素與阿霉素聯(lián)合組MMP-2、MMP-9表達水平最低。
　　4.將不同濃度的紫草素、阿霉素分別處理A549細胞24h及48h，MTT結果顯示紫草素和阿霉素均能以時間及劑量依賴性方式抑制肺癌A549

9、細胞增殖，與對照組相比均具有統(tǒng)計學差異。而紫草素和阿霉素之間對肺癌A549細胞增殖的抑制無明顯差異。用紫草素和阿霉素共同處理的A549細胞比單獨應用紫草素或者阿霉素處理細胞顯示出較少的活力，細胞存活率為53.77%，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異。5.紫草素與阿霉素合用組對肺癌A549細胞的集落克隆形成率明顯減少。
　　6.紫草素與阿霉素聯(lián)合用藥能有效誘導肺癌 A549細胞發(fā)生凋亡，其誘導的凋亡率明顯高于對照組、紫草素組、阿霉素組，差

10、異有統(tǒng)計學差異。
　　7.紫草素聯(lián)合阿霉素組較阿霉素組 S期細胞百分數(shù)增加，G0/G1期細胞百分數(shù)減少，兩藥聯(lián)合對細胞周期的影響最明顯。
　　8.紫草素能夠誘導肺癌A549細胞內(nèi)ROS的生成。
　　9.經(jīng)過不同藥物處理后，各組A549細胞內(nèi)ATP水平較對照組均有所降低，紫草素組與阿霉素組ATP下降率分別達到80%和81%，而紫草素與阿霉素聯(lián)合處理組A549細胞 ATP水平下降最明顯，達到60%。
　　10.紫草素

11、和阿霉素聯(lián)合處理組A549細胞內(nèi)線粒體膜電位降低明顯。
　　11.經(jīng)過不同的藥物處理，流式細胞儀顯示紫草素與阿霉素聯(lián)合處理組，A549細胞內(nèi)阿霉素濃度較對照組、阿霉素組均明顯升高，提示紫草素能夠顯著增加A549細胞中阿霉素的水平。
　　12.活細胞工作站顯示在分別接受紫草素、阿霉素處理后，能明顯提升 A549細胞內(nèi)阿霉素的熒光強度。
　　13. Westem-blot顯示：在空白對照組多藥耐藥蛋白1(multi-dru

12、g resistance protein1, MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和 P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)蛋白水平均有不同程度的表達。經(jīng)過紫草素或者阿霉素處理以后，這些耐藥蛋白的表達水平均較前下降，以紫草素和阿霉素聯(lián)合處理組下降最為明顯。
　　結論：
　　1.不同濃度的紫草素對A549細胞增殖具有抑制作用；紫草素能夠增強阿霉素

13、抑制A549細胞增殖作用。
　　2.不同濃度的紫草素能夠誘導A549細胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象；紫草素能夠增強阿霉素誘導A549細胞發(fā)生凋亡。
　　3.紫草素能夠抑制A549細胞的侵襲和遷移作用；紫草素能夠增強阿霉素抑制肺癌A549細胞的侵襲和遷移作用。紫草素增強阿霉素抑制肺癌A549細胞的侵襲、遷移能力可能與抑制MMP-2、MMP-9的表達有關。
　　4.紫草素能夠干擾肺癌A549細胞周期，誘導凋亡。
　　5.紫草素能夠