通心絡(luò)抑制缺氧誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖及其分子機制.pdf

1、目的:巨噬細胞是機體對病原體入侵做出防御的關(guān)鍵細胞，它參與炎癥的發(fā)生和消除雙重作用。當炎癥發(fā)生時，巨噬細胞分泌促炎細胞因子及iNOS等生物活性物質(zhì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠顯著影響巨噬細胞的炎癥應(yīng)答和生物學(xué)功能，參與多種疾病如感染，慢性炎癥和缺血的發(fā)生發(fā)展過程。
　　通心絡(luò)屬中國傳統(tǒng)中草藥，在臨床上廣泛用于治療各種心血管疾病，如動脈粥樣硬化、心肌缺血、中風(fēng)等，具有益氣活血、通絡(luò)止痛之功效，新近研究發(fā)現(xiàn)具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。

2、
　　本實驗通過體內(nèi)、外實驗觀察通心絡(luò)對缺氧誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧可以顯著誘導(dǎo)巨噬細胞缺氧誘導(dǎo)因子和炎癥相關(guān)基因的表達，通心絡(luò)可以通過下調(diào)上述基因的表達抑制巨噬細胞的增殖，減輕缺氧所致的炎癥反應(yīng)。
　　方法:用氯化鈷刺激RAW264.7細胞，建立化學(xué)誘導(dǎo)的巨噬細胞缺氧模型;用Real Time PCR和Western blot檢測RAW264.7細胞HIF-1α、TLR-4、iNOS、NF-κB的mRNA和蛋白表

3、達;MTS法檢測巨噬細胞增殖情況;建立慢性和急性缺氧小鼠模型，免疫組織化學(xué)染色法檢測肺組織中HIF-1α、TLR-4、iNOS、NF-κB表達情況，記錄急性缺氧小鼠存活時間和呼吸頻率。
　　結(jié)果:
　　1.氯化鈷促進RAW264.7細胞增殖為了研究缺氧對巨噬細胞生物學(xué)行為的影響，我們以RAW264.7細胞為研究對象，以氯化鈷作為缺氧誘導(dǎo)因素，觀察缺氧對巨噬細胞增殖的影響。MTS結(jié)果顯示，缺氧可以誘導(dǎo)RAW264.7細胞增殖，

4、濃度100μM時促增殖效果最明顯。
　　2.氯化鈷誘導(dǎo)HIF-1α、TLR-4、iNOS、NF-κB表達為了進一步研究缺氧促進巨噬細胞增殖的分子機制，我們進一步觀察了缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α和炎癥相關(guān)基因的表達。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，氯化鈷可以顯著誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和炎癥相關(guān)基因TLR-4、iNOS、NF-κB的表達。
　　3.通心絡(luò)抑制氯化鈷誘導(dǎo)的RAW264.7細胞增殖為了

5、研究通心絡(luò)對氯化鈷誘導(dǎo)的RAW264.7細胞增殖是否具有抑制作用，分別用不同濃度通心絡(luò)預(yù)孵育RAW264.7細胞后加入氯化鈷，MTS實驗觀察通心絡(luò)對巨噬細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，通心絡(luò)可以濃度依賴性的抑制氯化鈷誘導(dǎo)的RAW264.7細胞增殖。
　　4.通心絡(luò)抑制氯化鈷誘導(dǎo)的HIF-1α、TLR-4、iNOS和NF-κB的表達為了進一步探討通心絡(luò)抑制缺氧誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖的分子機制，我們分別采用RT-PCR和Western Blot

6、檢測缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和炎癥相關(guān)因子TLR-4、iNOS、NF-κB的表達，結(jié)果顯示，缺氧顯著誘導(dǎo)上述指標mRNA和蛋白的表達，通心絡(luò)預(yù)孵育明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的上述基因表達。
　　5.通心絡(luò)抑制慢性缺氧小鼠HIF-1α、TLR-4、iNOS和NF-κB的表達。
　　為了進一步在整體動物水平上驗證通心絡(luò)通過抑制炎癥信號通路逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的巨噬細胞增殖，我們構(gòu)建了慢性缺氧和急性缺氧小鼠動物模型，收集各組肺組織樣本。免疫組化結(jié)果

7、顯示，慢性缺氧組小鼠HIF-1α、TLR-4、iNOS、NF-κB蛋白表達明顯增多;通心絡(luò)抑制缺氧小鼠肺組織上述蛋白的表達。但是，通心絡(luò)不改善急性缺氧老鼠的存活時間以及蛋白的表達。
　　結(jié)論:
　　1.氯化鈷促進RAW264.7細胞增殖。
　　2.氯化鈷誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎性相關(guān)基因的表達。
　　3.通心絡(luò)抑制氯化鈷誘導(dǎo)的RAW264.7細胞增殖。
　　4.通心絡(luò)抑制氯化鈷誘導(dǎo)的RAW264.7細胞炎