DKK1抑制巨噬細胞內脂質沉積及其相關分子機制.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述：
　　第一部分 Ox-LDL調節(jié)巨噬細胞DKK1的表達及相關分子機制
　　研究背景：
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)病率與日俱增，易損斑塊發(fā)生的破裂和繼發(fā)的血栓形成，是誘發(fā)急性冠脈綜合征、心肌梗死和中風等多種疾病的主要機制之一。傳統(tǒng)觀點認為，動脈粥樣硬化始于血管壁內皮損傷，單核細胞募集并遷入內膜下轉變?yōu)榫奘杉毎R別并吞噬脂質形成泡沫細胞，同時募集白細胞、平

2、滑肌細胞等進入斑塊，積聚脂質、中央核心壞死，導致斑塊破裂的發(fā)生。
　　氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可以損傷內皮，誘導單核細胞趨化，促進平滑肌增殖遷移，加速泡沫細胞形成，引起炎癥反應，加劇脂質沉積等動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　研究目的:
　　(1)明確ox-LDL對巨噬細胞中DKK1的調節(jié)作用;
　　(2)明確LXRs在ox-LDL調節(jié)DKK1

3、中的作用;
　　(3)明確β-catenin與LXRs的相互作用在ox-LDL調節(jié)DKK1中的作用。
　　研究方法:
　　1.細胞培養(yǎng)
　　購自ATCC的人單核/巨噬細胞系以RPMI-1640（含10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素）懸浮培養(yǎng)。并以終濃度為160nM的PMA誘導貼壁為巨噬細胞，作為實驗的模型細胞。
　　2.細胞轉染
　　β-catenin、LXRα和LXRβ的siRNA和陰性對照Nega

4、tive control siRNA均由上海吉瑪公司合成，按照脂質體Lipo-2000的說明書進行轉染后，給予不同的刺激并檢測。
　　3.蛋白質印跡法(Western Blot)
　　提取不同刺激后細胞的蛋白，99℃加熱10分鐘，SDS-PAGE電泳，按照對應的分子量切膠，濕轉法轉膜，封閉，一抗孵育4℃過夜，洗膜后二抗孵育1小時20分鐘，洗去附著的二抗，化學發(fā)光，分析對應的蛋白條帶的灰度值。
　　4.實時熒光定量PCR

5、分析
　　刺激結束后利用Trizol法提取細胞中的總核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，測定提取的RNA濃度，使用TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應合成互補脫氧核糖核酸（Complementary Deoxyribonucleic Acid，cDNA），再使用TaKaRa公司的SYBR Green實時定量PCR試劑盒進行PCR反應，以測定DKK1和內參蛋白的mRNA表達情況。
　　研究結果：

6、
　　1.ox-LDL上調巨噬細胞DKK1的表達
　　2.經典Wnt通路參與ox-LDL對巨噬細胞中DKK1表達的調節(jié)
　　3.LXRα參與ox-LDL對巨噬細胞中DKK1表達的調節(jié)，而LXRβ不參與
　　4.ox-LDL下調巨噬細胞中LXRs與β-catenin的相互作用
　　結論：
　　(1) ox-LDL能夠上調巨噬細胞中DKK1的表達;
　　(2) ox-LDL能夠減少LXRα對β-ca

7、tenin的抑制作用來上調DKK1的表達。
　　第二部分 DKK1抑制巨噬細胞內脂質沉積及相關脂質受體的變化
　　研究背景：
　　DKK1與脂肪代謝存在著密不可分的關系。研究發(fā)現(xiàn)，DKK1能夠促進脂肪生成的過程，同時發(fā)現(xiàn)可源于脂肪細胞分布異常的成人肥胖，其脂肪生成過程異常主要由于經典Wnt通路的異?；罨偷退降腄KK1所致。在動脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細胞的脂質代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報道。
　　

8、巨噬細胞吞噬脂質變?yōu)榕菽毎趧用}粥樣硬化中起到了重要的作用。巨噬細胞的脂質代謝主要分為脂質的吞噬、轉化和排出三個過程來維持其穩(wěn)態(tài)和平衡。巨噬細胞通過胞膜受體識別攝取脂蛋白和脂蛋白顆粒，并運送到溶酶體后被分解為氨基酸及游離膽固醇。繼而酯酰輔酶A膽固醇脂酰轉移酶(ACAT)將其轉化為膽固醇酯儲存在胞質中。當膽固醇接收體如HDL、apoA-Ⅰ等存在時，胞內的游離膽固醇可經過胞膜上的受體ABCA1、ABCG1等外流，減少胞質內脂質過度沉積。<

9、br>　　在動脈粥樣硬化過程中DKK1與巨噬細胞的脂質代謝功能是否存在著一定的聯(lián)系未見報道。
　　研究目的：
　　(1)明確DKK1對巨噬細胞脂質代謝的作用;
　　(2)明確經典Wnt通路在DKK1調節(jié)脂質代謝中發(fā)揮的作用;
　　(3)明確巨噬細胞中DKK1對脂質受體LOX-1和ABCA/G1的調節(jié)及相關信號通路。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　本實驗使用的THP-1細胞系為單核/巨噬細

10、胞系，購自美國ATCC中心。將PMA加入培養(yǎng)基中，誘導細胞貼壁生長，成為THP-1來源的巨噬細胞。
　　2.細胞轉染
　　DKK1、β-catenin和STAT3的siRNA和陰性對照Negative contro1 siRNA均由上海吉瑪公司合成，脂質體轉染法轉染，具體步驟參照Lipo-2000的說明書進行。
　　3.蛋白質印跡法(Western Blot)
　　刺激結束后RIPA裂解液提取蛋白，加入5×蛋白上

11、樣緩沖液，煮沸，SDS-PAGE電泳，濕轉法轉膜，封閉，一抗孵育4℃過夜，洗去附著的一抗，對應的二抗室溫孵育，洗去附著的二抗，化學發(fā)光法檢測相應的蛋白灰度值。
　　4.細胞油紅O染色
　　刺激結束后，4％甲醛固定細胞，使用配制的油紅O工作液染色10分鐘，洗去浮色，蘇木素染核2分鐘，鹽酸酒精分化15秒，置于清水中返藍7分鐘，甘油明膠封片短期保存，并拍照統(tǒng)計脂質沉積情況。
　　研究結果：
　　1.DKK1抑制巨噬細胞

12、內脂質沉積
　　2.Wnt通路參與DKK1對巨噬細胞脂質沉積的抑制作用
　　3.DKK1通過抑制經典Wnt通路下調巨噬細胞脂質受體LOX-1的表達
　　4.DKK1通過活化STAT3通路上調巨噬細胞脂質受體ABCA/G1的表達
　　結論：
　　(1) DKK1能夠抑制巨噬細胞內脂質沉積;
　　(2) DKK1通過抑制Wnt/β-catenin通路下調LOX-1的表達;
　　(3) DKK1通過活

13、化STAT3通路上調ABCA/G1的表達。
　　第三部分 DKK1對巨噬細胞自噬水平的影響及其調節(jié)脂質代謝的作用
　　研究背景：
　　自噬(Autophagy)是真核生物進化過程中相對保守的生命現(xiàn)象，是指細胞利用溶酶體水解酶水解細胞內容物的過程，分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。巨自噬是指在饑餓等環(huán)境因素刺激下，胞質內形成雙層膜結構將胞質內容物包裹運送至溶酶體被水解酶降解的過程;而微自噬是指溶酶體直接吞噬胞質內容

14、物清除的現(xiàn)象;分子伴侶介導的自噬，是指在分子伴侶的協(xié)助下，胞內容物被運送至溶酶體降解的現(xiàn)象。
　　研究表明，Wnt/β-catenin通路對于基礎狀態(tài)和應激狀態(tài)下的自噬水平均起到負調控的作用;而自噬活化時β-catenin能夠發(fā)生自噬性降解來抑制Wnt通路，形成一個負反饋調節(jié)。然而自噬在DKK1對脂質代謝的調節(jié)過程中發(fā)揮著的作用尚未見報道。
　　研究目的：
　　(1)明確DKK1對巨噬細胞中自噬水平的影響;
　　

15、(2)明確自噬水平的改變是否參與DKK1對脂質代謝的調節(jié)。
　　研究方法：
　　1.細胞培養(yǎng)
　　本實驗使用單核/巨噬細胞系THP-1細胞。將THP-1細胞種板后，以PMA誘導為巨噬細胞作為實驗模型。
　　2.細胞轉染
　　DKK1 siRNA、ATG5 siRNA和Negative control siRNA均由上海吉瑪公司合成，對細胞進行脂質體轉染，轉染步驟按照Lipo-2000說明書進行。
　　

16、3.蛋白質印跡法(Western Blot)
　　給予不同刺激后RIPA裂解液提取細胞蛋白，煮沸，SDS-PAGE電泳，按照對應的分子量切膠，濕轉法轉膜，封閉，4℃一抗孵育過夜，洗膜，室溫二抗孵育1小時20分鐘，洗膜，化學發(fā)光法發(fā)光，分析蛋白條帶灰度。
　　4.巨噬細胞吞噬功能檢測
　　給予不同刺激后，加入ac-LDL刺激過夜，4％甲醛固定30分鐘，油紅O工作液染色10分鐘，洗去浮色，蘇木素染核2分鐘，鹽酸酒精去分化1

17、5秒，置于清水中返藍7分鐘后，甘油明膠封片，拍照并統(tǒng)計胞質內的脂質沉積情況。細胞給予不同刺激后，加入Dil-ac-LDL避光孵育過夜，棄去培養(yǎng)基，1×PBS沖洗細胞，4％甲醛固定，1×PBS沖洗細胞，DAPI染核8分鐘，1×PBS沖洗細胞，抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡549nm激發(fā)波長下檢測熒光強度，以檢測巨噬細胞對Dil-ac-LDL的吞噬能力。
　　研究結果：
　　1.DKK1上調巨噬細胞中自噬的水平
　　2.D

18、KK1通過上調自噬水平來抑制巨噬細胞中的脂質沉積
　　3.DKK1通過上調自噬水平來調節(jié)巨噬細胞脂質受體的表達
　　4.DKK1能夠通過自噬化降解下調巨噬細胞中的β-catenin的水平
　　結論：
　　(1) DKK1能夠上調巨噬細胞的自噬水平來抑制脂質代謝;
　　(2) DKK1通過自噬調節(jié)脂質受體LOX-1和ABCA/G1的表達。
　　(3) DKK1能夠促進巨噬細胞中β-catenin的自噬化