巨噬細(xì)胞對血管細(xì)胞的輻射旁效應(yīng)及其分子機(jī)制研究.pdf

1、電離輻射能夠?qū)е聞用}粥樣硬化(atherosclerosis，AS)首次報(bào)道于1959年。輻射和高血壓、高血脂、吸煙、糖尿病、肥胖、缺乏運(yùn)動以及年齡等均是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。電離輻射和其它的危險(xiǎn)因素一起共同作用于動脈血管，可加速AS的形成。AS主要累及大中型動脈，引起不同程度的血管管腔堵塞，使受阻動脈遠(yuǎn)端缺血而導(dǎo)致局部組織壞死。動脈粥樣硬化會導(dǎo)致冠心病，如果冠狀動脈狹窄達(dá)50％，臨床可出現(xiàn)因心肌缺血或壞死而引起的心絞痛、急性心肌梗死和心

2、律失常等嚴(yán)重疾病。電離輻射能直接導(dǎo)致受照射細(xì)胞損傷，受照射的細(xì)胞可以通過細(xì)胞介質(zhì)或細(xì)胞間隙連接通訊，將應(yīng)答反應(yīng)傳遞至未接受電離輻射的正常細(xì)胞，使正常細(xì)胞也出現(xiàn)與受電離輻射類似的生物學(xué)損傷反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為輻射旁效應(yīng)。
　　隨著放射治療腫瘤技術(shù)廣泛推廣，腫瘤患者接收放療后的遠(yuǎn)后生存成為熱點(diǎn)，因此不僅需要關(guān)注輻射直接導(dǎo)致的損傷，輻射旁效應(yīng)所導(dǎo)致的遠(yuǎn)后期損傷也逐漸受到關(guān)注。有研究表明輻射導(dǎo)致的動脈粥樣硬化以及并發(fā)的心腦血管疾病而導(dǎo)致的死

3、亡是放射治療腫瘤患者除患癌死亡以外最多見的并發(fā)癥，但是電離輻射導(dǎo)致心血管疾病的機(jī)制還不清楚，雖然它與年齡因素導(dǎo)致的動脈粥樣硬化是不同的。隨著全球受到環(huán)境和人工輻射人群的漸漸增多，需要去了解電離輻射誘發(fā)的動脈粥樣硬化的機(jī)制，為預(yù)防電離輻射誘發(fā)的心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。對于放射治療來說，絕大部分為身體局部受到照射，局部受照區(qū)域血管內(nèi)的單核/巨噬細(xì)胞受照射，而巨噬細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞，受到輻射后會有釋放大量生物活性因子，導(dǎo)致輻射旁效應(yīng)。因

4、此深入了解電離輻射誘發(fā)的動脈粥樣硬化，以及輻射旁效應(yīng)在輻射動脈粥樣硬化中作用為我們的防護(hù)工作提供新的思路。
　　本論文通過照射U937單核巨噬細(xì)胞，并將受照射的U937細(xì)胞和未受照射的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)建立共培養(yǎng)的模型，發(fā)現(xiàn)受照射的U937細(xì)胞可導(dǎo)致未受照射HUVECs的DNA損傷暨微核形成，受照射后的U937細(xì)胞上清中的NO濃度增加，細(xì)胞內(nèi)的iNOS蛋白表達(dá)增加。用不同濃度的外源性NO供體SNP處理HUVECs也導(dǎo)

5、致其微核增加，微核率與SNP濃度有關(guān)，而加入NO清除劑c-PTIO能夠減少SNP誘導(dǎo)的微核形成。iNOS抑制劑SMT預(yù)處理U937細(xì)胞，或者在共培養(yǎng)的體系內(nèi)加入NO清除劑c-PTIO，均能夠抑制HUVECs旁細(xì)胞的微核生成。同時(shí)受照射的U937細(xì)胞能夠?qū)е挛词苷丈涞腍UVECs凋亡率顯著提高、克隆形成率明顯降低。而SMT預(yù)處理U937和c-PTIO處理共培養(yǎng)的兩種細(xì)胞后，能夠完全抑制受照射U937誘發(fā)的HUVECs的凋亡，部分恢復(fù)了HU

6、VECs的存活率。提示受照射的U937細(xì)胞能夠通過iNOS激活釋放NO，誘發(fā)共培養(yǎng)的HUVECs產(chǎn)生DNA損傷、凋亡等輻射旁效應(yīng)。另外，HUVECs旁細(xì)胞的P38蛋白磷酸化顯著增加，p38抑制劑SB203580處理未受照射的HUVECs后，DNA損傷、細(xì)胞凋亡等輻射旁效應(yīng)明顯減弱，而細(xì)胞存活率顯著增強(qiáng)。同時(shí)，受照射U937細(xì)胞還使得與之共培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞膜表面VCAM-1的表達(dá)增加，使其與U937細(xì)胞的粘附能力顯著增強(qiáng)。然而SMT

7、和c-PTIO能夠抑制HUVECs的VCAM-1的表達(dá)，由于VCAM-1表達(dá)是調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞和HUVECs粘附的重要分子，因而NO抑制劑降低了HUVECs細(xì)胞與受照射U937細(xì)胞的粘附。當(dāng)用SB203580預(yù)處理HUVECs細(xì)胞，再與受照射的U937細(xì)胞共培養(yǎng)，HUVECs細(xì)胞的VCAM-1的表達(dá)完全受抑制，與受照射的U937細(xì)胞粘附降低至本底。受照射U937細(xì)胞還可明顯促進(jìn)HUVECs釋放活性MMP-9和MMP-2。但是當(dāng)受照射的靶

8、細(xì)胞U937受到SMT、c-PTIO的處理，或者HUVECs旁細(xì)胞受到SB203580預(yù)處理后，HUVECs細(xì)胞釋放活性MMP-9與MMP-2的能力顯著下降。這些結(jié)果揭示，受照射的U937細(xì)胞通過激活iNOS的表達(dá)并釋放大量的NO，進(jìn)而激活與之共培養(yǎng)的未受照射的HUVECs產(chǎn)生一系列炎癥相關(guān)的旁效應(yīng)，其中p38/MAPK通路發(fā)揮了重要作用。
　　在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們研究了受輻射巨噬細(xì)胞對血管平滑肌細(xì)胞HUSMC的遠(yuǎn)程旁效應(yīng)，暨

9、對增殖和遷移能力的影響。血管平滑肌細(xì)胞在動脈粥樣硬化過程中起著重要作用。利用Transwell小室建立了兩種細(xì)胞共培養(yǎng)的模型。一是受照射U937細(xì)胞和未受照射的HUSMC共培養(yǎng):U937細(xì)胞種植與小室內(nèi)，HUSMC種植于六孔板;另一個(gè)是受照射U937細(xì)胞和未受照射的HUSMC、HUVECs共培養(yǎng):U937懸浮細(xì)胞種植于小室內(nèi)，HUVECs種植于小室上，HUSMC種植于六孔板內(nèi)。發(fā)現(xiàn)受照射的U937細(xì)胞通過釋放的細(xì)胞因子TNF-α等促進(jìn)H

10、USMC增殖。在兩細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的HUSMC的增殖能力比三細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的HUSMC增殖能力強(qiáng)。而用外源性TNF-α處理HUSMC，可增加該細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)。在兩細(xì)胞和三細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，受照射U937細(xì)胞能夠?qū)е鹿才囵B(yǎng)體系條件培養(yǎng)液中MCP-1、IL-6顯著增加。兩細(xì)胞體系與三細(xì)胞體系相比，HUSMC的MCP-1、IL-6基因表達(dá)明顯增加，但是上清中的IL-6含量三細(xì)胞體系高于兩細(xì)胞體系;兩細(xì)胞體系上清中的MCP-1含量高

11、于三細(xì)胞體系。說明IL-6釋放有部分是來自于共培養(yǎng)體系中的HUVECs。MCP-1主要來自于HUSMC共培養(yǎng)體系中的炎癥因子TNF-α。
　　概括而言，本文研究表明:受照射的巨噬細(xì)胞能導(dǎo)致共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的粘附能力增強(qiáng)。此過程與內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO有關(guān)。而受照射的U937細(xì)胞能夠?qū)е挛词苷丈涞腍USMC的增殖能力增強(qiáng)。在這些過程中，一系列炎癥因子參與其中。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了輻射旁效應(yīng)能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞的損傷，平滑肌