hALR抑制ConA誘導(dǎo)淋巴細胞增殖作用的分子機制研究.pdf

1、第一部分運用基因芯片技術(shù)研究haLR的免疫調(diào)控作用的分子機制 目的：肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration，ALR)是一種非特異性、具有熱穩(wěn)定性、不同于以往已知的促肝細胞增殖的肝細胞再生因子。因為它不僅通過直接刺激肝細胞增殖，而且可能還通過免疫調(diào)控作用參與損傷肝臟的修復(fù)。我們的前期研究已證明，ALR在體外能以劑量依賴方式抑制ConA刺激的大鼠T淋巴細胞增殖作用，并能抑制APC遞呈的特異性抗

2、原刺激的T淋巴細胞的增殖，減少IL-2分泌。但目前對于ALR在免疫調(diào)節(jié)方面的分子作用機理還不十分明確。 本實驗擬利用基因芯片這一高通量技術(shù)，全面分析在hALR作用下ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞與單純經(jīng)ConA刺激的淋巴細胞的基因表達譜的差異，對所有表達的基因進行生物信息學(xué)分析，匯總整理出與hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖抑制作用相關(guān)的重要基因、分子功能和信號通路，為進一步闡明ALR免疫調(diào)控作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。 方法：

3、 1．hALR的原核表達、純化及活性鑒定：復(fù)蘇含有pQE30-hALR的原核表達質(zhì)粒的大腸桿菌SG13009，在異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)下進行表達，產(chǎn)物經(jīng)15％SDS-PAGE鑒定；用鎳離子親合層析柱(Ni-nitrilotriacetic acid resin，Ni-NTA)對表達產(chǎn)物hALR蛋白進行純化，用15％SDS-PAGE鑒定。3H-

4、TdR摻入法檢測hALR生物學(xué)活性。 2．采集正常人外周靜脈血，分離人血單個核細胞(PBMC)，并提取PBMC的總RNA。 3．應(yīng)用Affymetrix公司的人類HG-U133A plus 2.0芯片分別對hALR刺激下ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞和單純經(jīng)ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞基因表達譜進行全面分析。 4．用RT-PCR方法對基因芯片檢測結(jié)果進行驗證。 5．應(yīng)用Microsoft Excel、GCOS(數(shù)據(jù)處理

5、軟件)等軟件和相關(guān)網(wǎng)站對基因表達譜進行差異分析，并進行差異表達基因的GeneOntology分類以及差異基因的Pathway分析。 結(jié)果： 1、hALR在宿主菌SG13009中得到高效表達，表達產(chǎn)物分子量約為16KD，該蛋白經(jīng)親合層析純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶。<'3>H-TdR摻入法檢測證實該蛋白能以劑量依賴方式刺激人肝癌細胞株QGY增殖。 2、對兩張基因芯片進行差異分析后發(fā)現(xiàn)：當定義log<,2>

6、Ratio≧1時，上調(diào)基因有1422個，log<,2>Ratio≦-1下調(diào)基因有1053個；log<,2>Ratio≧2時，上調(diào)基因有257個，log<,2>Ratio≦-2時下調(diào)基因有170個。 3、分別選擇上調(diào)基因SMAD3與下調(diào)基因：B4GALT1經(jīng)半定量RT-PCR證實與基因芯片結(jié)果一致。 4、選擇500個上調(diào)及500個下調(diào)的基因進行Pathway分析，這1000個基因參與了131個信號通路，如經(jīng)典的MAPK s

7、ignaling pathway、JAK-STAT signaling pathway，Wnt signaling pathway，Apoptosis signalingpathway等。 結(jié)論 1、成功純化了原核表達的hALR蛋白，并對其進行了生物學(xué)活性鑒定。 2、成功完成了hALR刺激下ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞與單純ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞基因表達譜差異分析。 3、經(jīng)pathway分析表明：參與的信號通路

8、主要與增殖、生長、細胞凋亡等有關(guān)。主要的基因有Tp53，IL-1A，F(xiàn)AS，JunD，Bcl2，TNFRSF10A，MAP3K2等，這些基因也大多參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。 4、基因芯片表達譜差異分析為信號通路中的相關(guān)基因和與之相聯(lián)系的基因進行研究提供了可靠的依據(jù)。 第二部分MAPK信號通路與hALR抑制ConA誘導(dǎo)的T細胞增殖作用的關(guān)系 目的：前面的基因表達譜的差異分析研究提示：hALR對ConA誘導(dǎo)淋巴細胞增殖

9、的抑制作用涉及到MAPK signaling pathway等多個信號通路途徑，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細胞外信號引起細胞核內(nèi)反應(yīng)的通道之一，可參與細胞的形成、運動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程，本實驗旨在探討AMPK signaling pathway在hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖抑制作用這一生物學(xué)過程中的作用。而基因表達調(diào)控的關(guān)鍵步驟在于轉(zhuǎn)錄起始部位，其中轉(zhuǎn)錄因子對眾多基因的表達起著極為重要的調(diào)控作用，是連接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基

10、因表達的橋梁，本實驗選擇了與MAPK信號通路相關(guān)的三個重要轉(zhuǎn)錄因子AP-1，NFAT,SRE，分別運用分泌型堿性磷酸酶報告基因瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，研究這些與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對hALR的反應(yīng)，了解hALR對ConA誘導(dǎo)淋巴細胞增殖的抑制作用的作用機制。并用westernblotting免疫印跡法對有顯著變化的轉(zhuǎn)錄因子上游磷酸化激酶的表達進行驗證，以進一步明確hALR的免疫調(diào)控機制。 方法： 1．hALR對Co

11、nA誘導(dǎo)的Jurkat T細胞作用的研究：選擇生長狀態(tài)良好的JurkatT細胞，給予ConA刺激，并于刺激后6h給予不同濃度的hALR，以3H-TdR摻入法檢測JurkatT細胞的增殖情況。 2．分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒擴增，酶切鑒定：分別將啟動子上游含有AP-1，NFAT,SRE的反應(yīng)元件)的分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌進行質(zhì)粒擴增，并小量抽提質(zhì)粒，進行酶切鑒定。 3．分泌型堿

12、性磷酸酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染及分泌型堿性磷酸酶的檢測：分別用GeneJuice脂質(zhì)體將pAP1-SEAP、pNFAT-SEAP、pSRE-SEAP、pTAL-SEAP(陰性對照質(zhì)粒)，pSEAP2-control(陽性對照質(zhì)粒)瞬時轉(zhuǎn)染JurkatT細胞，轉(zhuǎn)染后24h給予ConA刺激，轉(zhuǎn)染后30h給予hALR；分別于給予hALR后0h、6h、18h吸取上清液，運用分泌型堿性磷酸酶檢測試劑盒進行檢測，以測定相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。

13、 4．Westem印跡法檢測AP1上游的關(guān)鍵激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達：選擇生長良好的JurkatT、細胞，給予ConA刺激，并于刺激后6h給予hALR；加入hALR后0h，6h，12h分別取細胞液，提取細胞總蛋白，經(jīng)蛋白定量后用Western印跡法檢測c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達。 結(jié)果： hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖在20ul-100ul/ml濃度范圍內(nèi)有明顯抑制作用，且

14、呈劑量依賴關(guān)系。 分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒經(jīng)擴增后酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。 瞬時轉(zhuǎn)染分泌型堿性磷酸酶報告基因載體后，堿性磷酸酶的檢測結(jié)果提示：ConA刺激可使轉(zhuǎn)錄因子AP-1，NFAT,SRE轉(zhuǎn)錄活性均增高(P<0.01)；給予hALR刺激后，實驗組(ConA+hALR)與對照組(ConA)比較，僅AP-1轉(zhuǎn)錄活性在刺激后6h和18h均有增高(P<0.01)，而NFA3、和SRE的轉(zhuǎn)錄活性均無顯著性差異(P>

15、0.05)。 Western印跡檢測AP1上游的關(guān)鍵激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表達結(jié)果顯示：單純在ConA刺激下，細胞均呈現(xiàn)明顯的p-JNK活性(P<0.01))；在hALR刺激下，ConA誘導(dǎo)的JurkatT細胞中p-JNK的表達水平在6h與12h,較單純ConA刺激組有明顯升高(p<0.01)；說明在hALR刺激下，p-JNK有過度表達。 結(jié)論： 驗證了hALR抑制ConA誘導(dǎo)的JurkatT淋

16、巴細胞增殖作用，并確定了hALR對JurkatT細胞作用的最適濃度。 對分泌型堿性磷酸酶(SEAP)報告質(zhì)粒進行了擴增及酶切鑒定，為實驗提供了質(zhì)量可靠的質(zhì)粒。 hALR的刺激可使ConA誘導(dǎo)的JurkatT細胞中，磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)發(fā)生過度表達，進一步使其下游的轉(zhuǎn)錄因子AP-1轉(zhuǎn)錄活性增高。提示：hALR對ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖抑制作用可能與JNK/MAPK信號通路的過度激活引起細胞發(fā)生凋亡有密