丹參酮ⅡA及Prohibitin蛋白在缺血-再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、目的:
　　 心肌缺血后,盡早恢復(fù)血流是防治缺血性損傷的基本措施。近年來,采用溶栓療法(thrombolytic therapy)、冠脈動脈成形術(shù)(coronary angioplasty)等多種新技術(shù)使缺血心肌重新恢復(fù)了血流,此乃再灌注。及早、完全和持續(xù)恢復(fù)血流灌注可以挽救缺血心肌,但與此同時(shí),再灌注本身也可對心肌產(chǎn)生不利影響,即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injur

2、y,MI/RI)。再灌注損傷可導(dǎo)致心臟功能障礙,影響患者的生活質(zhì)量甚至預(yù)后。因此探索心肌缺血再灌注損傷的防治措施及其機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本課題組的前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示,Prohibitin(PHB)蛋白在缺血再灌注損傷組和正常組間存在差異表達(dá),與國外研究結(jié)果不謀而合。但是,到目前為止,對于PHB蛋白功能的研究大多局限于腫瘤學(xué)方面,其在心肌細(xì)胞中的功能仍然知之甚少,為此,有必要探討PHB蛋白在心肌細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)

3、制。
　　 丹參是具有多種心血管活性的中藥,臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的防治。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)為丹參酮中含量最高的脂溶性活性成分。本課題以丹參酮ⅡA為研究對象,旨在了解丹參酮ⅡA對心肌缺血再灌注損傷的防治作用,并在細(xì)胞水平從抗氧化能力、拮抗鈣超載和能量代謝方面探討其對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,并了解其對PHB蛋白的調(diào)控作用。
　　 二、方法:
　　 動物水平:雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成5組,假手

4、術(shù)組(SH組)、模型組(MI/R組)、丹參酮ⅡA高劑量組、丹參酮ⅡA中劑量組、丹參酮ⅡA低劑量組。SH組大鼠灌服生理鹽水,手術(shù)時(shí)進(jìn)行冠脈穿線但不結(jié)扎；MI/R組大鼠灌服生理鹽水,手術(shù)時(shí)結(jié)扎冠狀動脈左前降支；丹參酮ⅡA高、中、低劑量組大鼠分別灌服丹參酮Ⅱ A藥液20mg/kg·d、10 mg/kg·d、5 mg/kg·d,2/日。采用經(jīng)典的冠脈結(jié)扎再松開的辦法制備動物模型。結(jié)扎冠狀動脈左前降支15min,然后松開再灌注30min。連續(xù)觀察

5、記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,并進(jìn)行室性心律失常評分。通過多導(dǎo)生理記錄儀同步記錄左室收縮壓(LVSP),左室舒張末壓(LVEDP)、左心室上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室下降最大速率(-dp/dtmax)、心率(HR),以評定心功能。采用用伊文思藍(lán)+氯化三苯硝基四氮唑紅雙重染色及稱重法測量心肌梗死范圍。手術(shù)結(jié)束后處死動物取左心室,將標(biāo)本分為兩部分,一部分浸入10％福爾馬林溶液,一部分凍存于-80℃?zhèn)溆?。常?guī)HE 染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變

6、；采用TUNNEL 法檢測心肌細(xì)胞凋亡；分別采用免疫組化法及免疫印跡法檢測心肌PHB蛋白的表達(dá)。
　　 細(xì)胞水平:采用差數(shù)貼壁法體外分離培養(yǎng)新生乳鼠心肌細(xì)胞,以200 μmol/L過氧化氫(H2O2)作用 2h 模擬心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,分別以丹參酮ⅡA高劑量(1×10-4mol/L)、中劑量(5×10-5mol/L)、低劑量(1×1O-5mol/L)在造模前干預(yù)24h。倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,采用MTT法檢測細(xì)胞

7、活力,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度([Ca2+]i)及心肌細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)的變化,檢測心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性,并檢測心肌細(xì)胞總抗氧化能力(T-AOC)、LDH活性、MDA含量、SOD活力、GSH-PX活力、CAT活力。分別采用免疫組化法及免疫印跡法檢測心肌PHB蛋白的表達(dá)。通過轉(zhuǎn)染PHB siRNA后并檢測上述各指標(biāo)的變化,研究PHB蛋白功能。
　　 統(tǒng)計(jì)分析:

8、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(x)±s表示。對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。若符合正態(tài)分布和方差齊性,則采用方差分析。若不符合正態(tài)分布和方差齊性,則采用秩和檢驗(yàn)。方差齊性時(shí)兩兩比較采用LSD法,方差不齊時(shí)兩兩比較采用Tamhane's T2法。多組計(jì)數(shù)資料的比較(各組AV評分)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法。各實(shí)驗(yàn)組不同缺血及再灌注時(shí)間點(diǎn)血流動力學(xué)指標(biāo)采用重復(fù)測量方差分析。

9、檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)α=0.05。
　　 三、結(jié)論:
　　 (1)心肌缺血再灌注損傷容易誘發(fā)室性心律失常,可導(dǎo)致心肌組織結(jié)構(gòu)的破壞,心功能的下降。丹參酮ⅡA對大鼠缺血再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用,可以明顯降低心律失常的嚴(yán)重程度,防止心肌組織結(jié)構(gòu)的破壞、改善心功能、抑制細(xì)胞凋亡。
　　 (2)過氧化氫介導(dǎo)的心肌損傷可導(dǎo)致氧化平衡體系的破壞、能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡等病理改變。丹參酮ⅡA可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心

10、肌細(xì)胞損傷,這可能與其增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活力,降低脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)細(xì)胞能量合成、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。
　　 (3)PHB蛋白具有顯著的抗氧化作用,并可增加ATP酶活性、抑制細(xì)胞鈣超載、抑制心肌細(xì)胞凋亡作用。
　　 (4)PHB蛋白在心肌缺血再灌注損傷及心肌細(xì)胞氧化損傷時(shí)呈高表達(dá),其表達(dá)增加可能為心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗損傷作用的代償性反應(yīng)。丹參酮ⅡA可顯著降低心肌缺血再灌注損傷時(shí)及氧化損傷時(shí)心肌細(xì)胞中PHB蛋白表達(dá)水平,其機(jī)制可