Dynamins在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制及Dynasore的保護(hù)作用.pdf

1、目的與背景:
　　近來(lái)發(fā)現(xiàn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開(kāi)放和關(guān)閉在心肌缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury, IRI）中起到非常重要的作用，同時(shí)線粒體的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)在很大程度上影響線粒體的功能，線粒體分裂蛋白(Drp1)可能在其中起到關(guān)鍵作用，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。Dynasore是一種發(fā)動(dòng)蛋白（Dynam

2、in）抑制劑，主要抑制Dynamin1，Dynamin2和Drp1的GTP酶活性。目前，有關(guān)Dynasore的研究主要集中在細(xì)胞內(nèi)吞方面，在心臟方面的研究幾乎缺乏。我們?cè)谟嘘P(guān)心肌細(xì)胞內(nèi)吞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)加用Dynasore后細(xì)胞死亡率降低，推測(cè)Dynasore可能有心肌保護(hù)作用。但是Dynasore是否有明確的心肌保護(hù)作用，其可能的保護(hù)作用是否是通過(guò)影響線粒體的形態(tài)和功能而產(chǎn)生尚不明確，另外，在心肌IRI中Drp1和Dynamin2的作用也

3、未明確。
　　方法:
　　我們用1μM、3μM、10μM濃度Dynasore事先干預(yù)原代分離的成年小鼠心肌細(xì)胞2小時(shí)，后加入H2O230分鐘后測(cè)定細(xì)胞存活率和活力（TBE測(cè)定法），以及心肌細(xì)胞內(nèi)ATP含量（cellTiter-Glo發(fā)光光度測(cè)定法）;測(cè)定Dynasore對(duì)非應(yīng)激狀態(tài)下HeLa細(xì)胞內(nèi)ATP的影響;并在氧化應(yīng)激狀態(tài)下(H2O2)加入外源性ATP后測(cè)定心肌細(xì)胞存活情況（TBE測(cè)定法）;同時(shí)予1μM濃度Dynasor

4、e全程治療(120分鐘預(yù)治療，30分鐘缺血，60分鐘再灌注)langendorff離體成年小鼠心臟，并測(cè)定其功能(LVESP、LVEDP、LVDP)、心肌梗死面積（PI測(cè)定法）及灌流液中TnI含量。在證實(shí)細(xì)胞內(nèi)吞抑制濃度(1～10μM)以下的Dynasore對(duì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的小鼠原代心肌細(xì)胞和IRI離體心臟均有心肌保護(hù)作用之后，進(jìn)一步在乳鼠原代分離心肌細(xì)胞中觀察線粒體的形態(tài)（MitoTracker(@) Mitochondrion-S

5、elective Probes熒光探針，激光共聚焦顯微鏡），mPTP開(kāi)放程度（TMRM測(cè)定膜電位推測(cè)開(kāi)放程度，激光共聚焦顯微鏡）以及Drp1和Dynamin2的蛋白表達(dá)情況。進(jìn)一步探討Drp1和Dynamin2在心肌IRI中的作用機(jī)制，以及mPTP在其中的作用，并初步探討Dynaosre對(duì)小鼠左室舒張末壓的作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　我們的結(jié)果顯示:(1)在langendorf

6、f灌注心臟，Dynasore組心肌梗死面積較對(duì)照組減少80％（分別為8.1％和39.6％，p＜0.001）;Dynasore組灌流液TNI濃度較對(duì)照組下降70％(p＜0.05)。(2)Dynasore組明顯改善LVEDP(mmHg)（再灌注前與對(duì)照組基本接近，再灌注后15、30、60分鐘與對(duì)照組分別為:4.6±3.7，3.3±4.3，0.0±4.8和21.6±3.7，25.2±6.6，24.9±4.8，p＜0.05），但不改變LVDP。

7、(3)氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞的存活度和活力明顯下降。而Dynasore明顯提高細(xì)胞的存活度，并顯著改善細(xì)胞的活力。(4) Dynasore增加存活的氧化應(yīng)激心肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度(p＜0.05)，外源性ATP能起到和Dynasore相似的心肌保護(hù)作用。但低劑量的Dynasore（1μM～3μM）不影響非氧化應(yīng)激下HeLa細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度，Dynasore的心肌保護(hù)作用的劑量明顯低于其有效抑制細(xì)胞內(nèi)吞的劑量。Dynasore這種細(xì)胞保護(hù)作

8、用是呈劑量依賴性的，并在脫血漿狀態(tài)下更明顯。(5)空白組細(xì)胞加用30μMH2O2后，線粒體形態(tài)發(fā)生變化，網(wǎng)絡(luò)化程度降低，融合過(guò)程受抑制，發(fā)生線粒體片斷化;經(jīng)1μM Dynasore預(yù)處理后心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)與未經(jīng)藥物預(yù)處理的細(xì)胞組相似，線粒體分裂的速度高于融合速度，網(wǎng)絡(luò)化程度降低，而3μM Dynasore預(yù)處理組的線粒體分裂程度相對(duì)較低;經(jīng)10μM Dynasore預(yù)處理的心肌細(xì)胞基本維持了線粒體的網(wǎng)絡(luò)狀形態(tài)，與50μM Mdivi-

9、1預(yù)處理的心肌細(xì)胞相似。(6)H2O2處理30分鐘后，空白組細(xì)胞線粒體分裂，線粒體膜電位發(fā)生去極化，電位明顯降低，大部分線粒體區(qū)域熒光消失;經(jīng)過(guò)不同濃度Dynasore和Mdivi-1藥物處理的細(xì)胞組，都呈現(xiàn)線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。10μM Dynasore預(yù)處理心肌細(xì)胞組只有極少部分區(qū)域的熒光消失，而其他藥物預(yù)處理組，熒光消失面積相對(duì)較大。(7)30μMH2O2可明顯增強(qiáng)Dynamin2的蛋白表達(dá)，也增強(qiáng)Drp1的蛋白表達(dá)，加用10μ

10、Mdynasore后明顯降低Dynamin2和Drp1的蛋白表達(dá)，基本恢復(fù)到基線水平;而加用50μM Mdivi-1后Drp1和Dynamin2的蛋白表達(dá)較加用30μMH2O2時(shí)下降，但仍未恢復(fù)到基線水平。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究在小鼠離體心肌缺血再灌注損傷模型上，證實(shí)了Dynasore的心臟保護(hù)作用，包括改善心臟功能，減少心肌細(xì)胞死亡和心肌梗死面積。
　　(2)我們的研究第一次提出Dynasore對(duì)IRI心臟具

11、有潛在的松弛作用。其機(jī)制可能是線粒體保護(hù)和氧化磷酸化的儲(chǔ)存。
　　(3) Dynasore是通過(guò)抑制Drp1，減少線粒體片段化、分裂、改善線粒體膜電位Δψm、減輕mPTP的開(kāi)放程度，從而發(fā)揮其心臟保護(hù)作用。
　　(4)抑制Dynamin2也可能對(duì)心臟起到一定的保護(hù)作用，但尚需做進(jìn)一步研究。
　　(5)本研究加深了對(duì)心肌IRI機(jī)制的再認(rèn)識(shí)，揭示了保護(hù)線粒體功能的藥物治療也許不僅僅有利于心肌細(xì)胞存活，也可能改善心臟舒張功能