rAAV-2-EGFP轉染神經(jīng)干細胞及植入MCAO大鼠紋狀體的實驗研究.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分：SD大鼠胚胎大腦皮質內(nèi)源性神經(jīng)干細胞體外分離培養(yǎng)及增殖分化的實驗研究。 目的:探討從SD大鼠胚胎大腦皮質額葉、頂葉體外分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞(Neural stem cell，Nscs)。 方法：本實驗采用含表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維生長因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)及無血清培養(yǎng)添加劑B2

2、7(B27 supplement)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)孕13.5天的SD大鼠胚胎大腦皮質額葉、頂葉NSCs。原代細胞克隆球形成后，以單細胞克隆、Brdu摻入及免疫熒光和Nestin免疫熒光證實所獲得的神經(jīng)細胞克隆球具有強分裂增殖能力和胚胎源性；另一部分細胞用含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)液誘導分化，一周后分別進行微管相關蛋白(microtubule associated pr

3、oteins-2，MAP-2)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillar)，acidic protein，GFAP)免疫熒光染色檢測以證實來源于孕13.5天大鼠額葉、頂葉皮質腦組織的NSCs具有分化成神經(jīng)元、星形膠質細胞的多向分化潛能。 結果：原代培養(yǎng)1周后，可形成大量懸浮生長的克隆球?？寺∏蚪?jīng)免疫熒光法檢測BrdU和Nestin均呈陽性，單細胞克隆可獲得大量的NSCs，誘導分化后，分化細胞MAP-2、GFAP免疫熒光呈

4、陽性。 結論：可以從SD大鼠胚胎大腦皮質額葉、頂葉中分離培養(yǎng)純化、擴增傳代獲得NsCs，作為進一步研究的NSCs來源。 第二部分：2型腺相關病毒重組增強型綠色熒光蛋白對培養(yǎng)神經(jīng)干細胞轉染效率的實驗研究。 目的：探討2型重組腺相關病毒(recombinam adeno-associated virus 2，rAAV-2)載體能否有效地轉染NSCs。 方法：采用含有增強型綠色熒光蛋白(enhanced gre

5、en nuorescem protein，EGFP)報告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP)，以感染復數(shù)(multiplicity ofinfection，MOI)分別為1×10<'4>、1×10<'5>、1×10<'6>轉染體外分離、培養(yǎng)的大鼠胎鼠NSCs，在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達；同時檢測子代細胞的活力、增殖倍數(shù)、分化情況來評估對其存活、增殖、分化能力的影響；當EGFP表達穩(wěn)定后，流式細胞儀檢測rAAV-2/EGFP

6、對NSCs的轉染效率。 結果：轉染10天后各轉染組便可觀察到NSCs克隆球發(fā)出綠色熒光，起始熒光強度不一，隨MOI值的增大而增強；各轉染組熒光強度隨時間的延長而逐漸增強，至轉染21天后達高峰并維持，此時流式細胞儀檢測rAAV-2對NSCs的轉染效率：MOI為1×10<'4>、1×10<'5>、1×10<'6>時轉染率分別為26.34％、50.97％、56.36％。熒光指數(shù)(FI)分別為4.01、12.70、14.08；轉染組和未

7、轉染組細胞培養(yǎng)7、14、21天時其細胞活力、增殖倍數(shù)、分化差異均無統(tǒng)計學意義。 結論：rAAV-2能有效地轉染NSCs，所介導的目的基因能高效表達。 第三部分：rAAV/EGFP轉染神經(jīng)干細胞植入局灶性腦缺血大鼠紋狀體的實驗研究。 目的：探討以rAAV-2/EGFP轉染體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)植入局灶性腦缺血(MCAO)模型大鼠紋狀體內(nèi)的遷移、分化表型及其對神經(jīng)功能、學

8、習與記憶能力的影響。 方法：rAAV-2/EGFP轉染體外培養(yǎng)的NSCs。大鼠隨機分為3組：1.正常對照組：即rAAV-2/EGFP轉染的NSCs植入正常大鼠紋狀體內(nèi)；2.腦缺血對照組：即生理鹽水植入局灶性腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)；3.腦缺血實驗組：即rAAV-2/EGFP轉染的NSCs植入局灶性腦缺血大鼠紋狀體內(nèi)(均n=6)。線栓法制成腦缺血對照組、腦缺血實驗組大鼠右側大腦中動脈閉塞(MCAO)：立體定向下向大鼠右側紋狀體內(nèi)注射相應

9、的移植物，移植后1周、2周、3周、4周、8周，神經(jīng)功能評分，同時進行Y型電迷宮檢測學習與記憶能力，用免疫熒光組織化學方法來檢測移植NSCs的遷移、分化。 結果：腦缺血實驗組各時間點的神經(jīng)功能評分、學習與記憶能力與腦缺血對照組相比較有顯著性差異(P<0.05)。腦缺血實驗組和正常對照組植入的NSCs能在宿主體內(nèi)存活，并與宿主有了一定的相容性。移植后第3周，腦缺血實驗組針道內(nèi)有少許植入的rAAV-2/EGFP轉染的NSCs向針道外遷

10、移，第4周，針道內(nèi)遷移的細胞不均勻地分布在其兩側，有向損傷灶遷移的趨勢，未見明顯細胞突起。至移植后第8周，植入的rAAV-2/EGFP轉染的’NSCs不但向損傷灶遷移，而且分化成神經(jīng)系統(tǒng)成熟細胞的形態(tài)，胞漿和突起均可見綠色熒光。分化的部分細胞可表達MAP-2，即有GFP/MAP-2雙陽性細胞，說明移植的細胞可分化為神經(jīng)元，但數(shù)目較少；另一部分細胞可表達GFAP，即有GFP/GFAP雙陽性細胞，說明移植的細胞也可分化為膠質細胞，且數(shù)目較多