轉(zhuǎn)染hTERT基因建立人永生化神經(jīng)干細胞系的實驗研究.pdf

1、神經(jīng)干細胞(Neuralstemcells,NSCs)是指神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有多潛能、自我復(fù)制、自我更新、自我維持并能分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞等特點的細胞。自1992年Reynolds和Weiss在成年小鼠紋狀體分離出神經(jīng)干細胞以來，現(xiàn)已從胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)中的多個部位，包括大腦皮層、海馬、紋狀體、嗅球、腦室沿線包括側(cè)腦室、第三腦室和第四腦室、間腦、中腦、小腦、脊髓、視網(wǎng)膜中分離得到NSCs或比NSCs具有更明確發(fā)展方向的神經(jīng)祖細

2、胞。在成體內(nèi)也存在兩個NSCs聚集區(qū)：側(cè)腦室壁的腦室下層(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranularzone，SGZ)。 目前神經(jīng)干細胞的體外分離、培養(yǎng)和擴增技術(shù)已較成熟，并且在誘導(dǎo)因子的作用下神經(jīng)干細胞在體外可分化為幾種終末的神經(jīng)細胞。 研究表明，神經(jīng)干細胞在體外培養(yǎng)需要有促有絲分裂原的參與，如表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或/和堿性

3、成纖維細胞生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)。鼠來源的神經(jīng)干細胞在以上條件下分裂增殖速度較快，約1d分裂1次，而人來源于的神經(jīng)干細胞分裂一次則需7～14d。在體外經(jīng)過有限次的傳代后，隨著端粒長度的縮短，細胞就會停止分裂增殖，發(fā)生衰老和死亡，這就限制了其應(yīng)用。 基因工程化的人神經(jīng)干細胞，由于其克隆性、穩(wěn)定性及快速增殖能力，可能更適合于細胞及分子生物學(xué)的研究。有學(xué)者提出了永生化神經(jīng)干細胞的概

4、念，永生化是指通過基因操作使細胞總是處于連續(xù)的細胞周期內(nèi)，從而阻止了其進一步分化。通常采用通過不同載體將編碼癌基因蛋白的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入胚胎神經(jīng)干細胞中的方法來獲得永生化神經(jīng)干細胞，目前以myc及SV40大T抗原應(yīng)用最為廣泛。國外已有人采取不同的方法建立了人永生化神經(jīng)干細胞系，如取自胚13周人海馬組織而建立的C10、JA3細胞系；胚15周人端腦的H6細胞系；胚10.5周人端腦的HNSC.100細胞系等，以上細胞系均用v-myc基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細

5、胞而來。永生化神經(jīng)干細胞除具有神經(jīng)干細胞的一般特點外，尚有以下優(yōu)點：(1)它們在體外可以自我更新，并能大量增殖；(2)能通過基因操作使細胞穩(wěn)定地表達報告基因及治療基因；(3)可以分離出單個細胞克隆；(4)通過加入了外源基因而獲得的永生化神經(jīng)干細胞，在體內(nèi)仍然能像神經(jīng)干細胞一樣具有多向分化潛能。 細胞永生化機制，在于轉(zhuǎn)入這些基因后，激活了體內(nèi)端粒酶活性，從而使細胞獲得了無限增殖能力，而達到永生化。在調(diào)節(jié)端粒酶活性的因素中，端粒酶催

6、化亞單位(humantelomerasereverseranscriptase，hTERT)是其限速因素，國外已有人采用hTERT轉(zhuǎn)染不同體細胞，獲得永生化細胞的報道。因此，我們用hTERT基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，以期獲得永生化的神經(jīng)干細胞系，為進一步研究神經(jīng)干細胞提供不斷的細胞供源。 在本課題中，我們成功分離、鑒定了孕10～14周流產(chǎn)的人胚胎大腦皮層來源的神經(jīng)干細胞，在將hTERT基因成功構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PLXSN)上后，將

7、PLXSN-hTERT轉(zhuǎn)染人胚神經(jīng)干細胞，獲得了人胚永生化神經(jīng)干細胞系，并將其移植到裸鼠體內(nèi)，證實不具有成瘤性，應(yīng)用安全。我們獲得的主要結(jié)果如下：1.分離、培養(yǎng)、鑒定了孕10～14周人胚胎腦皮層來源的神經(jīng)干細胞。 2.構(gòu)建并擴增、純化及鑒定了PLXSN-hTERT。 3.通過包裝獲得了PLXSN-hTERT逆轉(zhuǎn)錄病毒全病毒，并證實其在靶細胞中成功表達。 4.病毒上清可有效地轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細胞端粒酶活

8、性檢測明顯升高，且持續(xù)表達；同時hTERTmRNA的表達升高，但其表達水平與端粒酶活性不平行，轉(zhuǎn)染后早期升高，繼之下降并維持在一定水平，因此hTERTmRNA不能作為端粒酶活性檢測指標。 5.永生化神經(jīng)干細胞仍然保持未分化狀態(tài)，能夠自我更新、自我維持并具有多分化潛能，其生長速率明顯加快，分裂增殖能力明顯增強。 6.染色體分析及裸鼠移植試驗顯示hTERT轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞具有正常的二倍體，無致瘤性。 總之，本實驗成功地