星形膠質細胞與神經干細胞共培養(yǎng)對神經干細胞分化影響的實驗研究.pdf

1、前言
　　 神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的特點:能夠自我更新和增殖；具有向神經元和神經膠質細胞多向分化的潛能；免疫原性低；可長期培養(yǎng)。
　　 神經干細胞的作用:促進神經組織的修復；作為神經系統(tǒng)疾病基因治療的載體。
　　 神經干細胞存在于哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的多個部位。大鼠海馬是神經干細胞的主要聚集區(qū),利于獲取神經干細胞。新生大鼠海馬所占腦體積的比例較成鼠.大,便于取材。
　　

2、 星形膠質細胞能合成和分泌多種神經因子,促進神經干細胞的定向分化,對神經元的正常活動與代謝都有重要作用。大腦皮質是星形膠質細胞與神經元密切接觸的主要場所,從大腦皮質獲取星形膠質細胞,有利于認識星形膠質細胞的生物學作用。
　　 神經干細胞作為治療神經系統(tǒng)疾病理想的供體細胞,其作用主要是通過神經干細胞分化的神經元實現(xiàn)。神經干細胞的分化是神經干細胞的重要屬性之一,受諸多因素影響,但在很大程度上取決于微環(huán)境中神經因子的作用。
　　

3、 目的
　　 探討星形膠質細胞(Astrocytes)對誘導新生大鼠海馬神經干細胞分化為神經元的影響。
　　 材料和方法
　　 一、材料
　　 新生2-3d的正常Wistar大鼠12只。
　　 二、方法
　　 (一)神經干細胞的培養(yǎng)和鑒定
　　 新生2.3d的Wistar大鼠,無菌分離海馬組織,制成細胞懸液,在含堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth

4、factor,bFGF)、表皮生長因子(epidermal growthfactor,EGF)和B27的DMEM/F12(1:1)無血清培養(yǎng)基中進行神經干細胞的原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞大多數(shù)細胞球直徑達200μm時行傳代培養(yǎng),傳3代的細胞球行單克隆培養(yǎng)?？寺∏虻牟糠旨毎谐驳鞍?Nestin)免疫細胞熒光染色；部分細胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12進行誘導分化,5d后分別行神經元特異性烯醇化酶(neurone specific en

5、olase,NSE)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)、半乳糖腦苷脂(galactocerebroside,Galc)免疫細胞熒光染色。
　　 (二)星形膠質細胞條件培養(yǎng)液的收集
　　 新生2-3d的Wista大鼠,無菌分離出大腦皮質,制成細胞懸液,在含DMEM/F12(1:1)、15％胎牛血清的培養(yǎng)液中行星形膠質細胞的原代培養(yǎng)。用差速貼壁和室溫震蕩法純化星形膠質

6、細胞。傳3代后部分細胞行GFAP免疫細胞熒光染色,標記星形膠質細胞的純度；另一部分細胞換成NSCs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集細胞培養(yǎng)液即為星形膠質細胞的條件培養(yǎng)液(ACM)。
　　 (三)神經干細胞的誘導分化培養(yǎng)
　　 將單克隆培養(yǎng)的NSCs分為三組:對照組(A組)、ACM:NSCs(1:2)培養(yǎng)組(B組)和Astrocytes和NSCs共培養(yǎng)組(C組)。各組細胞分別接種于含不同培養(yǎng)液的六孔培養(yǎng)板的板孔中,進行誘導分化培

7、養(yǎng)。采用免疫細胞熒光染色及免疫蛋白印跡兩種檢測方法,檢測各組NSCs分化為神經元的比例及其NSE蛋白的表達情況。
　　 (四)統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件,對神經元的比例進行統(tǒng)計學分析,所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(-x±f)表示,組間比較采用t檢驗,P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果
　　 一、神經干細胞的鑒定結果
　　 單細胞克隆培養(yǎng)的細胞Nestin陽性表達,誘導分

8、化的細胞NSE、GFAP和GalC陽性表達。
　　 二、星形膠質細胞鑒定結果
　　 GFAP免疫細胞熒光染色顯示:96.5％細胞GFAP陽性,細胞純度適合做后續(xù)實驗。
　　 三、各組神經干細胞向神經元分化的結果
　　 各組神經干細胞誘導分化3d時,細胞貼壁分化的程度不同:B組、C組明顯比A組快；誘導分化7d時,免疫細胞熒光染色統(tǒng)計學結果表明:A組、B組、C組NSE陽性細胞的比例分別為:14.7％±3.5％