神經干細胞移植治療大鼠腦創(chuàng)傷的實驗研究.pdf

1、傳統觀念認為成年哺乳動物中樞神經系統不具備再生能力，這意味著成年動物腦和脊髓內的神經細胞只能因損傷、疾病、自然凋亡等因素逐漸減少，而不能被更新或替代。神經干細胞的發(fā)現打破了這一傳統觀念，十幾年來的研究發(fā)現：成年哺乳動物中樞神經系統的特定部位存在神經干細胞，在體外通過無血清培養(yǎng)，在細胞營養(yǎng)因子的作用下能夠增殖，形成神經球并可以連續(xù)傳代擴增，在血清等因子誘導下能夠分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。神經干細胞在體內平時處于相對靜止狀態(tài)

2、，在腦損傷等刺激因素作用下能夠增殖、遷移、并分化為神經元或神經膠質細胞，起到相應的生物學效應。創(chuàng)傷性顱腦損傷嚴重影響人類健康，造成沉重的社會負擔，是臨床醫(yī)生以及基礎研究工作者面臨的嚴峻課題，神經干細胞移植治療創(chuàng)傷性顱腦損傷前景廣闊。神經干細胞研究急需解決的問題是：建立完善的神經干細胞培養(yǎng)方法；深入了解神經干細胞的特性、分化機理及其與祖細胞的區(qū)別；定向誘導神經干細胞分化成為目的神經細胞；深入了解神經干細胞在中樞神經系統內的分化特點；選擇恰

3、當的神經干細胞進行移植，以實現中樞神經系統功能重建和解剖重建。 第一部分 胚胎大鼠神經干細胞體外培養(yǎng)分化的研究 目的 探討神經干細胞的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)方法，觀察神經干細胞增殖、傳代和分化的規(guī)律；比較不同部位、不同胎齡來源的神經干細胞的增殖、傳代和分化的差別；比較不同細胞因子對神經干細胞增殖、分化的影響，建立比較完善的神經干細胞培養(yǎng)方法。為深入研究神經干細胞的特性、分化機理、定向誘導分化提供基礎。

4、 方法 取12天胎齡的大鼠前腦中線部位的腦組織進行原代培養(yǎng)，分別取16天胎齡的大鼠大腦皮層、海馬、紋狀體和腦室下區(qū)進行原代培養(yǎng)，觀察神經干細胞的增殖、傳代及分化；比較不同胎齡來源的神經干細胞增殖和傳代能力的差別。比較相同胎齡、不同部位來源的神經干細胞增殖和傳代能力的差別。分別使用EGF、bFGF和EGF+bFG刺激細胞增長，觀察神經球形成率、神經球直徑，MTT法觀察不同細胞因子對細胞增殖率的影響。EGF+bFG刺激下對神經干細

5、胞進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察神經干細胞的增殖、分化規(guī)律。采取死活細胞分離、改良神經干細胞的原代分離方法和傳代方法以提高傳代次數。 結果 12天胎齡來源的神經干細胞增殖活力明顯強于16天胎齡來源的神經干細胞，快速分裂期出現早，克隆形成率高。細胞種植后24小時顯微鏡下觀察可見大量分裂期的神經干細胞，細胞呈對稱或不對稱分裂，呈啞鈴狀，連續(xù)觀察可見細胞分裂成兩個完全獨立的神經干細胞。如果胰蛋白酶消化過度或者滴管吹打用力過大，細胞增殖

6、活力就會受到影響，最遲在細胞種植后5-7天才能看到大量細胞分裂相。隨后神經干細胞進入快速增殖期，形成3-6個疏松連接的細胞團，隨著時間的延長，細胞不斷分裂，神經球逐漸增大，細胞之間結合更加緊密，細胞光亮，折光性好，核、漿比例大。12天胎齡大鼠來源的神經干細胞可培養(yǎng)4個月，傳代14一16次。孕齡相同，而取材部位不同，其神經干細胞的增殖活力和傳代次數也不相同。取材于孕16天的胎鼠腦室下區(qū)神經干細胞可培養(yǎng)2個月，傳代6-10次；而取材于孕16

7、天胎鼠大腦皮層的神經干細胞可培養(yǎng)1個月，傳代4-6次。隨著傳代次數的增多，培養(yǎng)時間的延長，形成“克隆球”的能力明顯減低，細胞增殖緩慢，細胞透光度下降，細胞質內出現顆粒，大部分神經球停止增殖，神經球出現毛狀突起，貼壁生長，部分細胞從神經球內向外遷移生長，并形成突起，向神經細胞分化，此時強力振蕩培養(yǎng)瓶，神經球仍可脫離瓶底，突起的細胞回縮，形成典型神經球，但是難以阻止神經球貼壁分化的過程。取未貼壁生長的神經球繼續(xù)傳代，還可以傳代2-4次，但是

8、增殖能力下降，貼壁分化加速，最終無法繼續(xù)傳代。根據MTT實驗結果表明EGF和bFGF刺激神經干細胞增殖，無EGF和bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)液中，神經干細胞逐漸凋亡，活細胞數量呈下降趨勢，EGF能夠刺激神經干細胞增殖，但是相對于bFGF其增殖作用較弱，bFGF組與EGF+bFGF組比較，刺激細胞增殖的作用沒有明顯差別。2-4天細胞生長活躍，此后細胞增殖趨緩。神經干細胞在細胞分化液中培養(yǎng)，細胞2小時后貼壁，逐漸形成突起，隨著培養(yǎng)時間延

9、長，突起逐漸延長，顯微鏡下呈現神經元和膠質細胞形態(tài)，部分神經元的軸突舍近求遠，與100μm以外的細胞形成突觸聯系。培養(yǎng)10天左右，細胞之間形成廣泛網絡聯系。免疫組織化學染色大部分細胞GFAP陽性，少量細胞NF、NSE或MBP陽性。 結論 胎齡越小，從中分離出的神經干細胞增殖能力越強，傳代次數越多；相同胎齡，從腦室下區(qū)分離的神經干細胞傳代次數和增殖活性明顯強于從海馬、紋狀體、皮層分離的神經干細胞；bFGF刺激神經干細胞增殖

10、的能力明顯強于EGF；神經干細胞存在固有的增殖分化規(guī)律，類似于胚胎中樞神經系統自然發(fā)育過程，培養(yǎng)方法的改進和細胞因子的刺激只能部分影響神經干細胞的成熟過程。隨著傳代次數的增加神經干細胞自然走向分化、停止增殖。 第二部分 神經干細胞移植治療大鼠液壓打擊腦損傷的實驗研究 目的 研究成年大鼠運動區(qū)液壓打擊損傷后，采用立體定向腦內注射法，將運動皮層來源的神經干細胞移植到運動皮層損傷灶，與海馬來源的神經干細胞運動

11、區(qū)移植進行比較，觀察神經干細胞原位移植后移植細胞的成活、分化以及大鼠神經功能改善情況，探討神經干細胞原位移植的優(yōu)越性。腦損傷灶內注射bFGF，與神經干細胞移植進行比較，觀察細胞營養(yǎng)因子治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用，進而探討創(chuàng)傷性顱腦損傷的修復機理，探索創(chuàng)傷性顱腦損傷更有效的治療方法。 方法 取18天胎齡的大鼠的運動皮層和海馬分別進行神經干細胞原代培養(yǎng)，傳代一次，在干細胞增殖活躍期進行BrdU標記。選取成年雄性大鼠48只，分為

12、對照組、皮層干細胞移植組、海馬干細胞移的植組以及bFGF治療組，運動區(qū)液壓打擊腦損傷3天后，分別進行損傷灶內神經干細胞移植和bFGF注射，治療后1、3、6、12周觀察行走試驗、平衡試驗以及走迷宮試驗，比較各組神經功能改善情況。進行免疫組織化學檢測，采取ABC法進行Brdu、NF、GFAP、Nestin、MBP染色，并進行HE染色觀察腦損傷情況以及損傷灶的修復情況。 結果 行走試驗：移植前各組行走試驗平均19秒左右，無顯著

13、差異，治療后一周各組大鼠行走功能均有明顯改善，其中bFGF組的功能改善尤為顯著，與對照組比較，海馬干細胞組和皮層干細胞組也有顯著改善(P＜0.01)。移植3周以后，各組行走功能繼續(xù)改善，皮層干細胞組的改善明顯強于其他各組，海馬干細胞組和bFGF組的后期療效與對照組無顯著差異(P＞0.05)。平衡試驗：移植前各組大鼠評分平均5-6分，無統計學差異，移植后第一周各組大鼠平衡功能明顯改善，其中bFGF組功能改善優(yōu)于對照組和海馬干細胞移植組(P

14、＜0.01)，相差非常顯著，皮層干細胞移植組的功能改善優(yōu)于對照組(P＜0.05)。第三周開始皮層干細胞移植組優(yōu)于其他三組，持續(xù)至第12周(P＜0.01)。其他三組之間恢復無差異。記憶試驗：移植前各組大鼠記憶能力無顯著差異，移植后第一周，各組大鼠記憶力顯著改善，bFGF組大鼠記憶能力顯著優(yōu)于其他各組(P＜0.05)，后期恢復過程中，皮層于細胞移植組和海馬干細胞移植組記憶力略優(yōu)于對照組(P＞0.05)，各組記憶能力無顯著差異。免疫組織化學檢

15、測：移植后1周，免疫組織化學染色顯示BrDU陽性細胞存活，呈圓形或橢圓形棕褐色細胞，細胞存在于移植部位，未見細胞遷移。移植后3周，移植細胞仍然存活，而且BrDU陽性細胞向移植部位以外遷移，連續(xù)切片法顯示移植細胞表達GFAP和NeuN，GFAP陽性細胞較多，移植細胞團中nestin陽性細胞基本消失。 結論 細胞因子損傷灶內注射以及神經干細胞損傷灶內移植都能改善創(chuàng)傷性腦損傷后的運動功能。神經干細胞存在固有的分化規(guī)律，腦內移植