活性氧影響腫瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡信號(hào)敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、該研究分為4部分:第一部分:固有ROS水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡信號(hào)敏感性的關(guān)系;目的:研究細(xì)胞固有ROS水平與腫瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡信號(hào)敏感性的關(guān)系;方法:利用流式細(xì)胞儀、電子顯微鏡等手段檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的固有ROS水平及其對(duì)As<,2>O<,3>促凋亡作用的敏感性并考察二者之間的相關(guān)性,干預(yù)細(xì)胞ROS水平觀察細(xì)胞對(duì)As<,2>O<,3>促凋亡敏感性的變化.結(jié)論:固有ROS水平是影響腫瘤細(xì)胞對(duì)As<,2>O<,3>的促凋亡作用敏感性的重要因素之一.

2、第二部分:ROS在As<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡中的作用;目的:探詢?cè)贏s<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡中,調(diào)控ROS水平的環(huán)節(jié)及ROS引發(fā)的下游事件.方法:利用流式細(xì)胞儀,clark氧電極等手段及撤藥實(shí)驗(yàn)、PT孔干預(yù)等方法檢測(cè)As<,2>O<,3>作用下凋亡的可逆性及呼吸鏈活性、線粒體跨膜電勢(shì)(Δψm)、細(xì)胞ROS水平等參數(shù)的變化,并考察它們之間的關(guān)系.結(jié)論:As<,2>O<,3>作用引起呼吸鏈的抑制,引發(fā)Δψm的升高

3、,由此造成ROS生成加速及ROS水平的升高,當(dāng)ROS水平突破一定閾值,引發(fā)了PT孔的不可逆開放,Δψm的消解乃至崩潰,并最終使細(xì)胞走向凋亡.因此,ROS是As<,2>O<,3>誘導(dǎo)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中的一個(gè)環(huán)節(jié).第三部分:As<,2>O<,3>誘導(dǎo)凋亡時(shí)ROS與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的關(guān)系;目的:近年研究表明ROS可激活MAPK增殖系統(tǒng)及轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB),從而啟動(dòng)一系列促增殖基因的表達(dá)和抗凋亡因

4、子的激活,有利于細(xì)胞的生存.該部分?jǐn)M考察As<,2>O<,3>誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡時(shí)ROS水平變化與NF-κB的關(guān)系.方法:利用凝膠電泳遷移率變遷分析(Electrophoretic mobility shiftassay,EMSA)、NF-κB報(bào)告基因、免疫熒光激光共聚焦掃描、Western blot等手段檢測(cè)As<,2>O<,3>作用下NF-κB是否被激活;利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以抑制NF-κB活性以確認(rèn)NF-κB的角色;通過抬高細(xì)胞的ROS水

5、平,考察NF-κB活化和Δψm變化的情況.結(jié)論:As<,2>O<,3>作用下NF-κB的活化和Δψm的消解在很大程度上都依賴于細(xì)胞ROS水平,凋亡最后是否得以發(fā)生決定于NF-κB活化(生存)和Δψm的消解(死亡)的相對(duì)強(qiáng)度.第四部分:白血病細(xì)胞中PML-RARα與解偶聯(lián)蛋白2、ROS水平的關(guān)系;目的:已知解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)可以降低細(xì)胞ROS生成的速率,來源于APL的NB4細(xì)胞具有特征性的PML-RARα融合蛋白.該部分?jǐn)M考察白血病

6、細(xì)胞PML-RARα與解偶聯(lián)蛋白2、ROS水平的關(guān)系.方法:應(yīng)用Western blot、免疫組化等手段檢測(cè)幾株白血病NB4、K562、HL60、U937中UCP2的分布,并考察UCP2水平與細(xì)胞固有ROS水平及凋亡敏感性的關(guān)系;UCP2表達(dá)質(zhì)粒強(qiáng)制轉(zhuǎn)染于NB4細(xì)胞,檢測(cè)固有ROS水平及凋亡敏感性的變化;利用Zn離子誘導(dǎo)表達(dá)載體,誘導(dǎo)PML-RARα表達(dá)于PR9(來源于U937)細(xì)胞,檢測(cè)UCP2及ROS水平的變化,以UCP2表達(dá)質(zhì)粒強(qiáng)