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1、目的:構(gòu)建1yGDI及AN191yGDI的帶有熒光標(biāo)記的真核表達(dá)載體并分析外源性表達(dá)1yGDI及AN191yGDI對(duì)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞放射敏感性的影響并分析其機(jī)制;研究恢復(fù)細(xì)胞P53蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞輻射誘導(dǎo)凋亡及LyGDI的影響。 方法: 1.設(shè)計(jì)1yGDI及AN191yGDI基因上下游引物,PCR擴(kuò)增基因片段,分別構(gòu)建pEGFP-DF-1yGDI及pEGFP-DF-AN191yGDI真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切、PCR、測(cè)序
2、驗(yàn)證其正確性;脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞MCF-7后免疫印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá),免疫組化觀察融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位; 2.脂質(zhì)體法以pcDNA3.1-wt p53轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,RT-PCR、免疫印跡法驗(yàn)證;生長(zhǎng)曲線法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的的變化;X射線照射后,克隆法檢測(cè)放射敏感性的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的改變,免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá); 3.利用構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI及AN191yGDI基因
3、的L929、A549細(xì)胞。檢測(cè)轉(zhuǎn)染lyGDI對(duì)輻射誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡率的影響,探究其對(duì)細(xì)胞放射敏感性的影響,免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:測(cè)序證明基因序列完全正確,免疫印跡和免疫熒光染色檢測(cè)到目的蛋白表達(dá);恢復(fù)細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)抑制了L929細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)LyGDI斷裂;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI及AN191yGDI的L929細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的凋亡率上升,輻射處理后觀察到融合蛋白斷裂成相對(duì)應(yīng)的LyGDI
4、及AN19LyGDI蛋白;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI的A549細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的凋亡率上升,增加細(xì)胞放射敏感性,在該細(xì)胞受到8 Gy60Coγ射線照射后4到24小時(shí)可以觀察到LyGDI蛋白斷裂成AN19LyGDI蛋白。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建帶有GFP綠色熒光標(biāo)記的pEGFP-DF-1yGDI及pEGFP-DF-AN191yGDI真核表達(dá)載體; 2.恢復(fù)L929細(xì)胞的P53表達(dá)抑制細(xì)胞增殖能力,增加細(xì)胞放射敏感性并發(fā)現(xiàn)P53外
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