水稻蠟質(zhì)合成代謝基因WSL3及WSL4的克隆和功能分析.pdf

1、陸地植物表面覆蓋著一層蠟質(zhì)層，蠟質(zhì)作為植物表面與環(huán)境之間的第一層屏障，具有重要的功能。蠟質(zhì)能防止植物水分的流失，能屏蔽過量的紫外線，能形成自潔式的表面抵御外來的灰塵，能作為物理屏障來抵擋害蟲和病原菌的侵害，還能在器官邊界確定上起到重要的作用。水稻作為重要的模式作物，對水稻蠟質(zhì)控制基因進行研究，進而利用其改良水稻的抗逆能力，具有重要的意義。本文以兩個水稻葉片蠟質(zhì)減少突變體Wax crystal-sparse leaf3(wsl3)和Wax

2、 crystal-sparse leaf4(wsl4)為材料，在表型鑒定的基礎上，利用圖位克隆技術對目標基因進行了分離，進一步對其功能進行了初步的研究，主要內(nèi)容如下：
　　1.蠟質(zhì)突變體wsl3和wsl4的表型分析
　　通過對日本晴組培突變體庫的篩選，獲得了水稻葉片蠟質(zhì)減少的突變體wsl3和 wsl4。兩個突變體均呈現(xiàn)葉片沾水的表型，且wsl4突變體比野生型株高略矮，分蘗數(shù)減少。透射電鏡(TEM)觀察發(fā)現(xiàn)wsl3和wsl4突

3、變體葉片表皮增厚。掃描電鏡(SEM)觀察發(fā)現(xiàn)突變體葉片表面蠟質(zhì)晶體顯著性降低。GC-MS測定發(fā)現(xiàn)盡管突變體葉片表面角質(zhì)含量與野生型相當，但是，突變體葉片表面蠟質(zhì)各成分含量相對于野生型則顯著性下降。生理學實驗表明，wsl3和wsl4突變體的細胞膜通透性都有一定程度的升高。
　　2.蠟質(zhì)代謝合成基因WSL3和WSL4的圖位克隆和功能驗證
　　利用圖位克隆技術，我們將WSL3定位于4號染色體InDel標記M-2396和M-2404

4、之間83 kb區(qū)間內(nèi)，對該區(qū)間的基因測序發(fā)現(xiàn)LOC_Os04g40730第一個外顯子的736和737的兩個連續(xù)的堿基GC突變?yōu)門T，導致了所編碼的蛋白質(zhì)第207位的氨基酸由丙氨酸突變?yōu)楸奖彼?。WSL4基因定位于3號染色體InDel標記M-6283和M-6341的58 kb區(qū)間內(nèi)，對該區(qū)間基因測序發(fā)現(xiàn)Loc_Os03g12030基因的1281位的堿基由G突變?yōu)锳，位于第二個外顯子上，導致了所編碼的蛋白質(zhì)第312位的氨基酸由纈氨酸突變?yōu)榧?/p>

5、硫氨酸。生物信息學分析結果表明LOC_Os04g40730和Loc_Os03g12030分別編碼KCR和KCS類蛋白，都是蠟質(zhì)合成途徑的基因。進一步的遺傳互補和RNAi干擾實驗表明這兩個基因即為目標基因。
　　3.WSL3和WSL4基因的時空表達分析及亞細胞定位
　　利用實時熒光定量RT-PCR和GUS表達實驗對WSL3和WSL4兩個基因的表達模式進行了分析。結果表明，WSL3和WSL4在根、莖、葉、花等各個組織中均有表達，

6、屬于組成型表達基因。構建WSL3和WSL4基因的亞細胞定位GFP載體，在煙草中瞬時表達，發(fā)現(xiàn)它們都能與ER marker共定位，表明WSL3和 WSL4蛋白都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。
　　4.WSL3蛋白具有脂肪酸延長酶活性
　　在酵母ybr159wΔ突變體中異源表達水稻的WSL3基因，其生長缺陷的表型能得到恢復。當WSL3基因與擬南芥的FAE1基因在ybr159wΔ突變體中共表達的時候，能在酵母ybr159wΔ突變體檢測到20:0