轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因小麥抗蚜性及建立高效小麥轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、小麥?zhǔn)侵袊褪澜缟献钪匾募Z食作物之一，但其生產(chǎn)正受到蟲害日益嚴(yán)重的威脅。應(yīng)用基因工程手段培育抗蟲品種已成為解決小麥蟲害的一種有效途徑。豫麥66是高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病小麥新品種，但該品種易感蚜蟲，限制了其產(chǎn)量潛力的進(jìn)一步發(fā)揮。植物凝集素是一類具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，存在于許多植物的種子和營養(yǎng)器官中?；谥参锬睾吞堑奶禺愊嗷プR別的特性，一般認(rèn)為植物凝集素不僅在植物體內(nèi)具有一定的功能，如作為氮源、特異的識別因子等，更重要的是它還可能作為防

2、御蛋白發(fā)揮作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種植物凝集素具有抵抗農(nóng)業(yè)害蟲的特性，特別是對蚜蟲等同翅目害蟲具有抗殺作用。此外，植物凝集素還可以抵抗植物病原性線蟲、真菌及病毒的侵染。雪花蓮凝集素是植物凝集素的一種，它屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素家族，對具有刺吸式口器的同翅目害蟲具有毒殺作用。本研究用基因槍法將雪花蓮凝集素基因(GNA14)轉(zhuǎn)入普通春小麥品種中-60634和生產(chǎn)上正在推廣的冬小麥高產(chǎn)品種——豫麥66中，分別獲得了抗蚜性良好的轉(zhuǎn)基因抗蚜小麥新材料。

3、但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，基因槍轉(zhuǎn)化法不僅轉(zhuǎn)化頻率偏低(平均1％左右)，而且使用費(fèi)用偏高，限制了大規(guī)模基因工程分子育種工作的開展。故應(yīng)用一種適用于普通24孔培養(yǎng)板的便攜式、可重復(fù)使用的環(huán)形電極，將外源基因轉(zhuǎn)入完整的小麥幼胚組織并獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，建立了一種環(huán)形電極電激法介導(dǎo)的簡便、快速、高效、經(jīng)濟(jì)的高頻率小麥基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 1．應(yīng)用基因槍轉(zhuǎn)化法將雪花蓮凝集素基因(GNA14)轉(zhuǎn)入普通春小麥品種中-60634 和生產(chǎn)上正在推廣的冬小

4、麥高產(chǎn)品種——豫麥66中，分別獲得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。對轉(zhuǎn)基因小麥當(dāng)代及其后代進(jìn)行PCR及Southern雜交檢測，證明外源基因 已穩(wěn)定整合到小麥基因組中。中-60634和豫麥66的外源基因轉(zhuǎn)化頻率均為0.37％。 2．抗蚜實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)化gma基因的小麥植株對我國北方冬麥區(qū)的主要麥蚜——麥 長管蚜和禾谷縊管蚜的抗性效果不盡相同。對禾谷縊管蚜，在接種當(dāng)代即表現(xiàn) 出明顯的毒殺作用。對麥長管蚜，則表現(xiàn)為蟲體發(fā)育減緩并且降低了其所生

5、產(chǎn) 的若蚜成活率。在自然放養(yǎng)條件下，gna基因則對這兩種麥蚜的取食均起到了一 定的抑制作用。 3．獲得20個(gè)豫麥66抗蚜新材料分別來自由8個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因T<,0>代抗蚜植株所獲得的73個(gè)T<,1>代轉(zhuǎn)基因單株。T<,0>代轉(zhuǎn)基因植株與對照相比對蚜蟲的抗性表現(xiàn)出極為顯著的差異，特別是禾谷縊管蚜在生態(tài)盒中的死亡率高達(dá)47.1％～71.7％，比對照(16.0％)提高31.1％-55.7％。T<,1>代植株開放接蚜鑒定，3w后觀察發(fā)

6、現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株未找到任何蚜蟲，推測可能遷移至對照植株上。2個(gè)中-60634抗蚜新材料表現(xiàn)為減緩蚜蟲蟲體發(fā)育并且降低若蚜成活率。 4.轉(zhuǎn)基因抗蚜豫麥66新材料的產(chǎn)量性狀及植株表型性狀和對照相比無明顯差異。在較小群體的產(chǎn)量比較試驗(yàn)中，北京地區(qū)均能達(dá)到折合8250kg／ha(相當(dāng)于550kg／畝)。 5.應(yīng)用環(huán)形電極電激法有效地將外源DNA導(dǎo)入了完整的小麥幼胚組織中。經(jīng)PCR和Southern雜交分析表明，外源基因已穩(wěn)定整合進(jìn)

7、小麥基因組。以普通春小麥品種京紅5號為例，轉(zhuǎn)化頻率為7.5％，高于相同處理?xiàng)l件下基因槍法的轉(zhuǎn)化頻率(4.2％)。 6.環(huán)形電極電激法介導(dǎo)的高頻率小麥基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：將預(yù)培養(yǎng)3～4 d的小麥幼胚放于24孔培養(yǎng)板中，每孔約40個(gè)幼胚，室溫加入300μL電激液。電激液以0．6 mol／L蔗糖作為高滲劑，同時(shí)附加10 mmol／LNaCl、2mmol／LCaCl<,2>.2H<,2>O、2mmol／LCa(NO<,3>)<,2>.4H<,

8、2>O、5：mmol／LHEPES和100μg/ml質(zhì)粒DNA，pH值為6.0。 幼胚在真空度25英寸汞柱下抽真空3次，每次5 sec，置于室溫20 min并冰浴5 min后用于電激。電激時(shí)幼胚組織置于冰上并重復(fù)電激3次。電激的物理參數(shù) 采用770 V／cm場強(qiáng)、800μF電容。電激后組織于冰上保持10 min，室溫靜置2 h，逐步移去電激液，且每次補(bǔ)加相同體積的普通MS液體培養(yǎng)基，重復(fù)2～3次，重復(fù)間間隔1 h，以后移去所有溶液并