柑橘高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與類(lèi)胡蘿卜素代謝相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、柑橘是世界上最重要的水果之一，果實(shí)品質(zhì)一直是柑橘育種追求的主要目標(biāo)。長(zhǎng)期以來(lái)，童期長(zhǎng)、珠心胚、性器官敗育以及遺傳上的高度雜合等因素一直嚴(yán)重影響著柑橘育種工作的開(kāi)展?；蚬こ痰陌l(fā)展為柑橘的育種工作開(kāi)辟了一條新的途徑，從而使利用單個(gè)基因改造柑橘的品質(zhì)成為可能。本研究利用章期較短的早實(shí)枳作為轉(zhuǎn)化材料，建立并優(yōu)化了其高效再生和遺傳轉(zhuǎn)化的體系，以期使其成為柑橘基因功能驗(yàn)證和研究的平臺(tái)。利用該轉(zhuǎn)化體系和RNA干涉技術(shù)，獲得了一批與柑橘類(lèi)胡蘿卜素代謝

2、相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化材料，并對(duì)這些材料進(jìn)行了分子鑒定和基因表達(dá)的初步分析，本研究主要取得了以下結(jié)果：
　　 1.建立了早實(shí)枳（Poncirus trifoliata[L.]Raf.）和Cocktail葡萄柚（C. paradisi Macf.×C. reticulata Blanco.）的高效再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)若干影響再生和轉(zhuǎn)化效率的因素，如外植體的綠化、共培養(yǎng)條件，激素的組合和用量，篩選的方法等進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)黃化的早實(shí)枳莖段

3、或Cocktail上胚軸進(jìn)行4-5 d的光照處理，可以顯著提高外植體的再生能力和轉(zhuǎn)化率；共培養(yǎng)過(guò)程中，0.4.mg L-1的2,4-D可顯著提高外植體的轉(zhuǎn)化率，而過(guò)高的2,4-D濃度（0.6-0.8 mg L-1）則抑制不定芽的再生，降低轉(zhuǎn)化率。培養(yǎng)基G（MT+1 mg L-1 BA+0.1 mg L-1 NAA）對(duì)正常芽的再生最有利，過(guò)高的BA濃度（大于1.5 mg L-1）雖然能提高芽的數(shù)量，但也造成大量畸形芽的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，

4、潮霉素對(duì)早實(shí)枳莖段的再生有強(qiáng)烈的抑制作用。在早實(shí)枳再生試驗(yàn)中，通過(guò)嫁接再生的早實(shí)枳有36.4％（8/22）只需要9個(gè)月就能開(kāi)花，而通過(guò)生根再生的植株在第12個(gè)月時(shí)有32％（8/25）的植株開(kāi)花，第20個(gè)月時(shí)，這些再生植株有87.2％（41/47）開(kāi)花。這表明早實(shí)枳早花早果的特性可以經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)和再生過(guò)程穩(wěn)定地遺傳給后代，可以用于柑橘功能基因的研究。
　　 2.構(gòu)建了BCH基因片段的反義表達(dá)載體pCABCH，并用于轉(zhuǎn)化伏令夏橙（C

5、。sinensis Osb.cV.Valencia）的胚性愈傷組織，得到了6個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株系，并測(cè)定了抗性愈傷組織中類(lèi)胡蘿卜素含量的變化，結(jié)果表明，大部分轉(zhuǎn)化愈傷中葉黃素和α-胡蘿卜素的含量有所增加。50-60 mg L-1的潮霉素對(duì)伏令夏橙愈傷組織的再生影響較大，強(qiáng)烈抑制再生植株的生長(zhǎng)。
　　 3.構(gòu)建了CRTISO基因片段的反義表達(dá)載體pBICI，分別轉(zhuǎn)化了早實(shí)枳和山金柑，得到了23株早實(shí)枳再生植株，其中12株P(guān)CR檢測(cè)呈陽(yáng)

6、性；得到轉(zhuǎn)化山金柑4株。
　　 4.分別以LCYB的基因序列片段，和LCYE基因的5’和3’端片段，構(gòu)建了pLCYB，pLCYE1和pLCYE2的RNAi表達(dá)載體，并用于轉(zhuǎn)化早實(shí)枳和Cocktail葡萄柚。Real-time PCR結(jié)果表明，在LCYE基因被抑制的的早實(shí)枳植株中，PDS基因的表達(dá)量顯著增加，LCYB和ZEP基因的表達(dá)量下降。HPLC分析表明，發(fā)生LCYE基因抑制的植株葉片中，α-胡蘿卜素含量的下降，β-胡蘿卜素的

7、含量和紫黃質(zhì)的含量增加，而葉黃素的含量沒(méi)有顯著的變化。但β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量卻與其基因的表達(dá)水平呈反比1據(jù)此我們推測(cè)，對(duì)LCYE基因的干涉可能通過(guò)某種機(jī)制激活了上游PDS基因的活性。而β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量增加可能與代謝物質(zhì)的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)：隨著PDS基因表達(dá)量增加，上游ζ-類(lèi)胡蘿卜素和番茄紅素的含量增加，導(dǎo)致下游的代謝產(chǎn)物β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量顯著增加，而這些代謝產(chǎn)物對(duì)其本身的合成基因LCYB和ZEP又產(chǎn)生了反饋抑制作用。