抗豬流行性腹瀉病毒豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、目前，市場上預(yù)防豬流行性腹瀉的主要疫苗均為弱毒苗和滅活苗，2010年冬季以來，豬流行性腹瀉在我國又開始了爆發(fā)流行，即使是商品化的疫苗也難以快速控制該病的發(fā)展，說明主動(dòng)免疫在免疫系統(tǒng)發(fā)育不健全的仔豬上難以發(fā)揮保護(hù)作用，因此，利用基因工程手段研發(fā)新型重組抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫就成為了另外一個(gè)選擇。
　　本文在前人開發(fā)的抗PEDV雜交瘤細(xì)胞2D1的基礎(chǔ)上，通過提取雜交瘤細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得全套cDNA，以此為模板，利用17對(duì)引物擴(kuò)增重鏈可

2、變區(qū)基因，利用19對(duì)引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因，篩選出2株VH序列和1株VL序列以及特異性擴(kuò)增抗體可變區(qū)引物；另一方面，將原核表達(dá)的PEDV S1蛋白免疫昆明白鼠，獲得陽性抗血清，提取脾細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄全套cDNA，以此為模板，利用篩選出的特異性引物擴(kuò)增抗體VH序列和VL序列，其中一株重鏈可變區(qū)單克隆SH2與雜交瘤細(xì)胞中抗體重鏈可變區(qū)基因序列VH5100％相同，一株輕鏈可變區(qū)單克隆SL2與雜交瘤細(xì)胞中抗體輕鏈可變區(qū)基因序列VL匹配率達(dá)

3、到97.18%，由此可以確定抗PEDV抗體的VH序列（366bp）和VL序列（354bp）；與此同時(shí)，通過提取豬脾細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄全套cDNA，以此為模板，利用特異性引物擴(kuò)增獲得抗體Fc序列（363bp）；通過SOE-PCR方法拼接得到單鏈抗體scFv（765bp）和scFv-Fc（1128bp），經(jīng)過IgBlast分析后，兩種單鏈抗體均具有典型結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建原核表達(dá)載體pEASY-scFv和pET28a-scFv-Fc，通過原核表達(dá)

4、系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分別表達(dá)，理論分子量分別為32KDa和45.8kDa，利用SDS-PAGE和Western-Blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，通過間接Elisa鑒定該重組蛋白與PEDV的結(jié)合活性；最后，利用HRP anti-lebeled6×His和HRP Goat anti-Swine兩種抗體對(duì)scFv和scFv-Fc進(jìn)行雜交。結(jié)果表明，通過原核表達(dá)產(chǎn)生的兩種重組抗體均具有抗原結(jié)合活性，包含F(xiàn)c段的scFv-Fc具有能被Goat anti-