豬氨基肽酶對豬流行性腹瀉病毒在細胞上增殖的影響.pdf

1、豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種以嘔吐、腹瀉、嚴重脫水為主要臨床癥狀的高度接觸性傳染病。該病是我國及世界養(yǎng)豬國家引起仔豬早期死亡的重要疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重經濟損失。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是Ⅰ群冠狀病毒的成員。目前對于PEDV感染機理方面的研究較少，2007年Li等證實豬氨基肽酶（porcine aminopeptidase

2、N，pAPN）為PEDV的功能性細胞感染受體。至今，還未見其它有關PEDV感染機理以及pAPN在PEDV感染過程中作用的研究報道。
　　 本項研究以病毒與特異性受體的作用是病毒感染繼而大量增殖的基礎為理論依據。首先在PEDV敏感細胞系Vero細胞中添加不同濃度的天然pAPN，并通過Vero細胞先吸附pAPN1h，不棄去pAPN吸附液，感染PEDV、先吸附pAPN1h，棄去pAPN液體，再感染PEDV和pAPN與PEDV在試管內作

3、用1h后共同孵育Vero細胞等幾種不同作用方式，通過蝕斑計數方式，觀察pAPN對PEDV增殖的作用。結果表明，在Vero細胞中添加pAPN可增加蝕斑數，促進病毒增殖，其中添加5μg/mlpAPN蝕斑數最多，與病毒對照孔比較差異極顯著，隨著pAPN濃度的降低，蝕斑數逐漸減少，直到pAPN為0.1μg/ml時，與病毒對照比較差異不顯著。并發(fā)現只有在pAPN先吸附于Vero細胞再接種PEDV，且將pAPN一直留在病毒感染體系中，這種添加方式能

4、夠最好的發(fā)揮pAPN對PEDV增殖的促進作用；將PEDV與pAPN在體外感作后吸附細胞，產生的蝕斑數少于病毒對照孔。
　　 用天然pAPN制備了抗pAPN多克隆抗體，利用該多抗，通過間接免疫熒光法檢測ST細胞及Vero細胞表面氨基肽酶的存在情況。結果顯示ST細胞和Vero細胞均發(fā)出黃綠色熒光，但Vero細胞熒光亮度比ST細胞弱。說明兩種細胞均含有氨基肽酶，但Vero細胞中氨基肽酶的含量少于ST細胞。為進一步確定：PEDV與pAP

5、N結合的特異性，研究了抗pAPN抗體對PEDV增殖的影響以及對pAPN功能的影響。蝕斑減數試驗結果顯示抗pAPN抗體可以抑制PEDV在Vero細胞上的增殖，且可以抑制游離pAPN對PEDV增殖的促進作用，間接證明了病毒與受體結合的特異性。
　　 為進一步探究pAPN的功能，研究了pAPN對PEDV吸附、侵入細胞的影響。結果顯示，添加pAPN后，蝕斑數明顯增加，病毒的侵入率由66.1％提高至82.2％，說明pAPN參與病毒的侵入過

6、程，且對其有促進作用。添加pAPN試驗組的吸附率比對照組吸附率約下降18％。目前，對PEDV的理化特性方面的研究較少，不能確定4℃是否僅能吸附不能侵入，本研究借鑒其它病毒的研究方法，探索PEDV的感染機理，雖不能確定pAPN在病毒吸附過程中的作用，但對進一步研究PEDV感染機制及pAPN功能等都有較高的參考價值。
　　 為研究pAPN蛋白上與PEDV特異性結合的受體功能域，將pAPN基因截短獲得目的基因J-P1、JP2，利用大腸

7、桿菌表達系統(tǒng)pET32a（+）（E.coliRosetta），分別表達了JP1、JP2蛋白，用純化后蛋白免疫小鼠制備相應的多克隆抗體。用ST細胞，經IFA鑒定JP1、JP2兩蛋白的反應原性，結果顯示抗JP1、JP2抗體均能與ST細胞表面的pAPN反應。通過蝕斑減數法研究抗JP1、JP2抗體對PEDV增殖的影響，結果顯示，抗JP2抗體不能抑制PEDV在Veto細胞上的增殖；抗JP1抗體能夠抑制PEDV在Vero細胞上的增殖，但其抑制作用比