豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的分離培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一類(lèi)急性、高度接觸性傳染病，主要臨床癥狀為嘔吐、腹瀉、脫水性下痢。因PED對(duì)新生仔豬的高致死率，所以每次爆發(fā)都會(huì)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是主要發(fā)病國(guó)之一，自2010年起該病的發(fā)病率明顯升高，且規(guī)模更大。
　　由于近年來(lái)豬流行性腹瀉的頻繁爆發(fā)，使其成為世界范圍的豬傳染病。2013年5月美國(guó)首次報(bào)道豬流行性腹瀉案例，并且短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)散蔓延。同年，QiChen等成功分離

2、出美國(guó)傳播的兩株P(guān)EDV流行毒株。本實(shí)驗(yàn)室近些年來(lái)致力于PEDV減毒活疫苗的研究工作，已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，相繼得到了不同類(lèi)型的重組PEDV，但尚未進(jìn)行過(guò)PEDV流行毒株的分離培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)嘗試以Vero細(xì)胞分離出PEDV-GJL野毒株，為今后PEDV的疫苗研發(fā)和相關(guān)基礎(chǔ)研究建立基礎(chǔ)。
　　纖突蛋白（S蛋白）在決定PEDV宿主噬性方面發(fā)揮重要作用，而編碼纖突蛋白的S基因突變率較高，S基因的分子流行病學(xué)研究在PEDV防控研究中發(fā)揮著越來(lái)

3、越重要的作用。本研究首先進(jìn)行樣本中PEDV野毒株S基因的分段擴(kuò)增和基因進(jìn)化樹(shù)分析，然后借鑒QiChen等的培養(yǎng)方案，以期在Vero細(xì)胞上分離出臨床樣品中的PEDV-GJL野毒株。
　　基因進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，樣品中兩野毒株與國(guó)內(nèi)各地區(qū)近幾年的流行毒株在同一遺傳支系。隨后樣品中野毒株的分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)得到的毒株在Vero細(xì)胞上的CPE并非常見(jiàn)流行毒株的合胞體狀態(tài)，而是類(lèi)似DR13毒株引起的病變形態(tài)。進(jìn)一步做對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示病毒的增殖不依賴外

4、界胰酶的存在，故懷疑毒株是DR13毒株。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)ORF3序列，發(fā)現(xiàn)分離到的是PEDV-GJL和疑似DR13減毒疫苗株的混合毒株，并且病毒增殖傳至第四代時(shí)野毒株P(guān)EDV-GJL丟失。取第二代病毒進(jìn)行兩次空斑純化實(shí)驗(yàn)，分別挑取大、小不同蝕斑后得到的病毒經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)基因序列與弱毒DR13疫苗株高度同源。
　　由分離純化結(jié)果分析，豬場(chǎng)免疫過(guò)弱毒DR13疫苗，采集的臨床糞便樣品中攜帶有疫苗毒株。病毒接種后維持液中添加TPB和酵母粉是