基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)食品蛋白質(zhì)糖基化的研究.pdf

1、本論文主要采用基于生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，包括傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)、多級(jí)質(zhì)譜以及氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)(HDX-MS)研究了食品蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外在加工條件對(duì)蛋白質(zhì)糖基化的影響機(jī)制，并對(duì)糖基化蛋白質(zhì)的構(gòu)象進(jìn)行解析;采用一整套蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，包括全體蛋白質(zhì)的提取分離、蛋白質(zhì)的鑒定，應(yīng)用SDS-PAGE技術(shù)、膠內(nèi)酶解技術(shù)以及超高效液相色譜-多維質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋清中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行鑒定，并對(duì)其中各組分的糖基化程度

2、和位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明:
　　 (1)卵清蛋白的二硫鍵被還原后其結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致其糖基化程度提高，在干熱狀態(tài)下，其糖基化肽段從6增加到11個(gè)，在溶液狀態(tài)下從1增加到2個(gè);且高反應(yīng)物濃度和能量傳遞效率導(dǎo)致干熱反應(yīng)糖基化程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于濕熱反應(yīng);通過(guò)鑒定糖基化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)卵清蛋白的糖基化位點(diǎn)主要是賴(lài)氨酸殘基;通過(guò)結(jié)合卵清蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其糖基化位點(diǎn)受多種因素的影響，包括蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、氫鍵以及相鄰氨基酸的組成;卵清蛋白經(jīng)還原后再糖基化

3、提高了蛋白質(zhì)的乳化性和泡沫性質(zhì)。
　　 (2)卵清蛋白與食品加工過(guò)程中常見(jiàn)的四種還原糖在高溫溶液中反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，卵清蛋白-葡萄糖和卵清蛋白-麥芽糖體系的褐變程度、還原力和DPPH清除力最大;而卵清蛋白-葡萄糖和卵清蛋白-乳糖體系具有較高的TEAC值，是制備抗氧化劑的一種有效方式;卵清蛋白-糖在溶液中反應(yīng)后其產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)與其褐變程度具有一定的相關(guān)性，顏色越深，抗氧化活性越高;不同的糖基化產(chǎn)物的熱力學(xué)性質(zhì)不同

4、，糖基化可以改變卵清蛋白的熱穩(wěn)定性。
　　 (3)將卵清蛋白與葡萄糖在一定的條件下反應(yīng)后使其部分糖基化，通過(guò)胃蛋白酶酶解后采用高分辨率質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)的糖基化程度及其位點(diǎn)，再采用氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)研究糖基化后蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。結(jié)果表明，糖基化后的卵清蛋白經(jīng)氫氘交換后大部分肽段被保護(hù)，表明糖基化后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定;卵清蛋白糖基化和非糖基化的區(qū)域構(gòu)象均發(fā)生變化，表明糖基化不僅可以影響其糖基化位點(diǎn)局部的構(gòu)象變化，而且可影

5、響其遠(yuǎn)處的構(gòu)象。
　　 (4) DHPM預(yù)處理可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)，提高BSA的糖基化程度并增加糖基化位點(diǎn);100 MPa下的DHPM預(yù)處理對(duì)BSA的糖基化影響最大，糖基化位點(diǎn)由7個(gè)增加至11個(gè)，大部分肽段的DSP值在100 MPa時(shí)最大;糖基化反應(yīng)結(jié)合高分辨率的質(zhì)譜分析可以用來(lái)探測(cè)壓力誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化;DHPM誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)去折疊以及糖基化反應(yīng)的加快表明DHPM為食品加工過(guò)程中糖基化反應(yīng)的控制提供了一種有效方法。

6、r>　　 (5)采用氫氘交換質(zhì)譜的方法研究不同條件DHPM對(duì)BSA構(gòu)象的影響，結(jié)果表明BSA經(jīng)DHPM處理后BSA結(jié)構(gòu)被破壞，總體結(jié)構(gòu)變松散，結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ趨于去折疊狀態(tài)，結(jié)構(gòu)域Ⅰ被保護(hù)，趨于穩(wěn)定;不同壓力處理導(dǎo)致其去折疊程度不同，在100MPa時(shí)，去折疊程度最大;肽段的去折疊程度與糖基化程度相關(guān)，與上章中糖基化程度和糖基化位點(diǎn)結(jié)論基本一致。
　　 (6)蛋清蛋白中含有47種不同的蛋白質(zhì)，分子量分布很廣，從4248到275408