靶向UL5的siRNA對Ⅱ型單純皰疹病毒抑制的實驗研究.pdf

1、目的：應用RNA干擾技術研究靶向II型單純皰疹病毒UL5基因的siRNA對病毒的干擾作用。
　　 方法：在GeneBank上查找HSV-2 UL5基因全序列，使用siRNA在線設計軟件對UL5的靶基因序列進行初步篩選；對候選靶mRNA進行二級結構預測和熱動力學參數分析以及脫靶分析。用BLAST分析排除與其它基因有高度同源性的序列。本實驗從UL5基因中篩選出了五條序列作為靶序列并由靶序列分別設計合成出對應的正、反義寡核苷酸。siR

2、NA通過轉染載體LipofeCtamine2000脂質體轉染HEK293細胞，轉染12小時后收集并固定細胞，熒光顯微鏡下觀察轉染效果。收集轉染48小時后的細胞進行熒光定量RT-PCR和病毒滴度檢測，觀察其干擾效果。
　　 結果：Cy3熒光標記的siRNA轉染入HEK293細胞12小時后，收集細胞在熒光顯微鏡下可見熒光小點，而未轉染siRNA的細胞未見熒光，說明siRNA已經成功轉染入細胞內。熒光定量RT-PCR結果顯示，siRN

3、A722、siRNA2394、siRNA2513和s1RNA2627均可不同程度降低靶mRNA表達，siRNA2627抑制效果最好；陰性對照組和siRNA374對靶mRNA表達無影響。病毒滴度檢測結果顯示siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度，陰性對照組和siRNA374對病毒感染滴度無影響。
　　 結論：1、運用生物信息學軟件有助于特異性siRNA的優(yōu)化