EGFR靶向單鏈抗體制備及介導siRNA內(nèi)化NSCLC細胞的生物學效應.pdf

1、目的：
　　EGFR-TKIs耐藥引起腫瘤進展是當前NSCLC治療的主要重點和難點，siRNA可沉默耐藥相關(guān)基因表達但缺乏靶向性。為提高siRNA的靶向性，本研究設(shè)計并優(yōu)化EGFR靶向單鏈抗體核苷酸序列，在大腸桿菌中表達后，純化人源性抗EGFR單鏈抗體(scFv，s-9R)融合蛋白，并對純化產(chǎn)物的抗原結(jié)合活性、細胞內(nèi)化活性及核算攜帶能力進行鑒定；研究s-9R攜帶siRNA在體內(nèi)、外的抗腫瘤活性。
　　方法：
　　1.根

2、據(jù)人源性抗EGFR抗體輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列，設(shè)計、合成其單鏈抗體核酸表達序列，將輕鏈與重鏈核酸序列通過G4S連接肽相連并在核酸序列末端加入九聚精氨酸及His.tag表達序列，以構(gòu)建scFv及s-9R融合基因。將測序正確的融合基因連接入原核表達載體pGEX-4T-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,誘導表達后行親和層析純化并酶切GST.tag。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定后，ELISA分析融合蛋白的抗原結(jié)合

3、活性，凝膠遷移阻滯實驗檢測s-9R與核酸的結(jié)合活性，間接免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測檢測融合蛋白的內(nèi)化活性。
　　2.scFv及s-9R與EGFR-siRNA，MET-siRNA，KRAS-siRNA及HER2-siRNA分別混合后，加入H1975，H1993，A549，SPC-A1，PC-9及H69細胞培養(yǎng)液中共孵育，同時加入/不加入Gefitinib。通過RT-qPCR，Western blot實驗分析基因表達水平；通過MTT實驗

4、、流式細胞學實驗、平板克隆實驗分析EGFR-TKIs細胞藥物敏感性。
　　3.使用近紅外染料Dylight800 NHS Ester對單鏈抗體融合蛋白進行標記，經(jīng)鼠尾靜脈對H1975細胞荷瘤裸鼠注射標記后的融合蛋白，活體成像觀察融合蛋白在腫瘤部位富集及全身代謝過程。使用Cy5熒光染料標記siRNA，經(jīng)H1975細胞荷瘤裸鼠鼠尾靜脈注射融合蛋白/Cy5-siRNA,活體成像觀察融合蛋白/Cy5-siRNA在腫瘤部位富集及全身代謝過程

5、。經(jīng)鼠尾靜脈注射融合蛋白/EGFR-siRNA混合物，并同時Gefitinib灌胃，觀察裸鼠荷瘤變化；經(jīng)鼠尾靜脈注射融合蛋白/HER2-siRNA混合物，觀察裸鼠荷瘤變化。剝離荷瘤組織后對組織切片進行免疫組化實驗，觀察 EGFR、HER2、Ki67表達情況；對組織切片進行TUNEL標記，觀察細胞凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.pGEX-4T-1-scFv及pGEX-4T-1-s-9R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，IP

6、TG誘導表達融合蛋白scFv及s-9R，經(jīng) SDS-PAGE及Western blot證實表達成功；ELISA分析證實兩條單鏈抗體融合蛋白具有良好的EGFR結(jié)合活性；凝膠遷移阻滯實驗表明s-9R具有核酸結(jié)合活性；間接免疫熒光及流式細胞術(shù)實驗顯示兩條單鏈抗體融合蛋白能夠特異性結(jié)合并內(nèi)化入EGFR陽性的腫瘤細胞中，而不能內(nèi)化入EGFR表達陰性腫瘤細胞中；s-9R可以攜帶FAM-siRNA結(jié)合并內(nèi)化入EGFR陽性的腫瘤細胞中，而scFv則無此

7、功能。
　　2.s-9R可以攜帶EGFR-siRNA，MET-siRNA，KRAS-siRNA及HER2-siRNA內(nèi)化入腫瘤細胞中，并下調(diào)細胞中EGFR、MET、KRAS、HER2基因的表達；聯(lián)合應用Gefitinib后 H1975、H1993及 A549細胞的凋亡水平較對照組明顯提高；s-9R/HER2-siRNA混合物可以使 SPC-A1，PC-9增殖能力、克隆形成能力降低，細胞周期出現(xiàn)G1期停滯。
　　3.小動物活體

8、成像顯示兩條單鏈抗體融合蛋白本身能夠通過循環(huán)系統(tǒng)富集于裸鼠荷瘤部位，其中s-9R可以攜帶Cy5/FAM熒光素標記的siRNA富集于裸鼠荷瘤部位，并內(nèi)化入瘤細胞中；經(jīng)鼠尾靜脈注射s-9R/EGFR-siRNA混合物聯(lián)合Gefitinib灌胃，或單獨經(jīng)鼠尾靜脈注射s-9R/HER2-siRNA混合物可以使裸鼠荷瘤生長受到明顯抑制，病理切片顯示腫瘤細胞靶蛋白表達減少，增殖能力下降，凋亡細胞增多，荷瘤血管形成能力降低。實驗組裸鼠生存時間延長，移

9、植瘤成瘤率下降，荷瘤體積變小、重量減輕。
　　結(jié)論：
　　所設(shè)計、構(gòu)建的EGFR靶向單鏈抗體scFv及s-9R可以在體內(nèi)、外特異性的識別結(jié)合EGFR表達陽性NSCLC細胞。s-9R可以攜帶特異性siRNA內(nèi)化入腫瘤細胞之中抑制靶蛋白表達，發(fā)揮siRNA的生物學作用，具有恢復Gefitinib敏感性，抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。我們的研究為解決當前NSCLC臨床治療中所面對的酪氨酸激酶抑制劑耐藥問題，以及治療以HER