2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  EGFR-TKIs耐藥引起腫瘤進展是當前NSCLC治療的主要重點和難點,siRNA可沉默耐藥相關(guān)基因表達但缺乏靶向性。為提高siRNA的靶向性,本研究設(shè)計并優(yōu)化EGFR靶向單鏈抗體核苷酸序列,在大腸桿菌中表達后,純化人源性抗EGFR單鏈抗體(scFv,s-9R)融合蛋白,并對純化產(chǎn)物的抗原結(jié)合活性、細胞內(nèi)化活性及核算攜帶能力進行鑒定;研究s-9R攜帶siRNA在體內(nèi)、外的抗腫瘤活性。
  方法:
  1.根

2、據(jù)人源性抗EGFR抗體輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列,設(shè)計、合成其單鏈抗體核酸表達序列,將輕鏈與重鏈核酸序列通過G4S連接肽相連并在核酸序列末端加入九聚精氨酸及His.tag表達序列,以構(gòu)建scFv及s-9R融合基因。將測序正確的融合基因連接入原核表達載體pGEX-4T-1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),誘導表達后行親和層析純化并酶切GST.tag。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定后,ELISA分析融合蛋白的抗原結(jié)合

3、活性,凝膠遷移阻滯實驗檢測s-9R與核酸的結(jié)合活性,間接免疫熒光和流式細胞術(shù)檢測檢測融合蛋白的內(nèi)化活性。
  2.scFv及s-9R與EGFR-siRNA,MET-siRNA,KRAS-siRNA及HER2-siRNA分別混合后,加入H1975,H1993,A549,SPC-A1,PC-9及H69細胞培養(yǎng)液中共孵育,同時加入/不加入Gefitinib。通過RT-qPCR,Western blot實驗分析基因表達水平;通過MTT實驗

4、、流式細胞學實驗、平板克隆實驗分析EGFR-TKIs細胞藥物敏感性。
  3.使用近紅外染料Dylight800 NHS Ester對單鏈抗體融合蛋白進行標記,經(jīng)鼠尾靜脈對H1975細胞荷瘤裸鼠注射標記后的融合蛋白,活體成像觀察融合蛋白在腫瘤部位富集及全身代謝過程。使用Cy5熒光染料標記siRNA,經(jīng)H1975細胞荷瘤裸鼠鼠尾靜脈注射融合蛋白/Cy5-siRNA,活體成像觀察融合蛋白/Cy5-siRNA在腫瘤部位富集及全身代謝過程

5、。經(jīng)鼠尾靜脈注射融合蛋白/EGFR-siRNA混合物,并同時Gefitinib灌胃,觀察裸鼠荷瘤變化;經(jīng)鼠尾靜脈注射融合蛋白/HER2-siRNA混合物,觀察裸鼠荷瘤變化。剝離荷瘤組織后對組織切片進行免疫組化實驗,觀察 EGFR、HER2、Ki67表達情況;對組織切片進行TUNEL標記,觀察細胞凋亡情況。
  結(jié)果:
  1.pGEX-4T-1-scFv及pGEX-4T-1-s-9R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,IP

6、TG誘導表達融合蛋白scFv及s-9R,經(jīng) SDS-PAGE及Western blot證實表達成功;ELISA分析證實兩條單鏈抗體融合蛋白具有良好的EGFR結(jié)合活性;凝膠遷移阻滯實驗表明s-9R具有核酸結(jié)合活性;間接免疫熒光及流式細胞術(shù)實驗顯示兩條單鏈抗體融合蛋白能夠特異性結(jié)合并內(nèi)化入EGFR陽性的腫瘤細胞中,而不能內(nèi)化入EGFR表達陰性腫瘤細胞中;s-9R可以攜帶FAM-siRNA結(jié)合并內(nèi)化入EGFR陽性的腫瘤細胞中,而scFv則無此

7、功能。
  2.s-9R可以攜帶EGFR-siRNA,MET-siRNA,KRAS-siRNA及HER2-siRNA內(nèi)化入腫瘤細胞中,并下調(diào)細胞中EGFR、MET、KRAS、HER2基因的表達;聯(lián)合應用Gefitinib后 H1975、H1993及 A549細胞的凋亡水平較對照組明顯提高;s-9R/HER2-siRNA混合物可以使 SPC-A1,PC-9增殖能力、克隆形成能力降低,細胞周期出現(xiàn)G1期停滯。
  3.小動物活體

8、成像顯示兩條單鏈抗體融合蛋白本身能夠通過循環(huán)系統(tǒng)富集于裸鼠荷瘤部位,其中s-9R可以攜帶Cy5/FAM熒光素標記的siRNA富集于裸鼠荷瘤部位,并內(nèi)化入瘤細胞中;經(jīng)鼠尾靜脈注射s-9R/EGFR-siRNA混合物聯(lián)合Gefitinib灌胃,或單獨經(jīng)鼠尾靜脈注射s-9R/HER2-siRNA混合物可以使裸鼠荷瘤生長受到明顯抑制,病理切片顯示腫瘤細胞靶蛋白表達減少,增殖能力下降,凋亡細胞增多,荷瘤血管形成能力降低。實驗組裸鼠生存時間延長,移

9、植瘤成瘤率下降,荷瘤體積變小、重量減輕。
  結(jié)論:
  所設(shè)計、構(gòu)建的EGFR靶向單鏈抗體scFv及s-9R可以在體內(nèi)、外特異性的識別結(jié)合EGFR表達陽性NSCLC細胞。s-9R可以攜帶特異性siRNA內(nèi)化入腫瘤細胞之中抑制靶蛋白表達,發(fā)揮siRNA的生物學作用,具有恢復Gefitinib敏感性,抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。我們的研究為解決當前NSCLC臨床治療中所面對的酪氨酸激酶抑制劑耐藥問題,以及治療以HER

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