林生地霉致病性的動物實驗研究.pdf

1、目的：Geotricumsivicola是地霉屬新發(fā)現(xiàn)的一個種，目前國內(nèi)外有關(guān)的報道極少。2002年我科從一位膿癬病人的病發(fā)及痂皮部位首次分離出此菌，由中國醫(yī)學科學院微生物研究所鑒定為Geotricumsivicola，原翻譯為昔維考拉地霉，現(xiàn)根據(jù)其拉丁文原意譯為林生地霉。李秀麗等從形態(tài)學、營養(yǎng)生理學、分子生物學等各個角度對林生地霉進行初步研究，并且通過皮膚感染的動物實驗及毛發(fā)受侵試驗對其致病力進行了初步探討。 本研究通過不同途

2、徑給予不同免疫狀態(tài)下的昆明小鼠注射林生地霉，檢測是否能夠引起系統(tǒng)性的林生地霉感染，并且觀察不同免疫狀態(tài)下動物的死亡情況，同時對自然死亡和分期處死的小鼠進行解剖，通過直接鏡檢、組織逆培養(yǎng)、組織病理學檢查、組織載菌量測定等方法比較各臟器的感染程度以及電鏡觀察該菌在組織中的形態(tài)。為進一步了解此菌的致病力和引起的病理形態(tài)學改變提供實驗室依據(jù)。 方法：1林生地霉系統(tǒng)感染動物模型的制作將我科保存菌種復溫，轉(zhuǎn)種在沙堡氏培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)一周。

3、用無菌生理鹽水制備成菌懸液，通過皮下、腹腔、靜脈三種途徑接種至不同免疫狀態(tài)的小鼠。 2死亡率的觀察連續(xù)觀察各組小鼠感染該菌后4周內(nèi)的自然死亡情況，記錄死亡日期和死亡只數(shù)。 3感染內(nèi)臟的大體觀察將不同感染時間的動物解剖，分別取出肝、腎、脾、肺、心，觀察各臟器是否腫大或萎縮、有無顏色改變、各臟器表面的膿灶計數(shù)等。 4直接鏡檢肉眼可見感染灶的臟器取膿灶處小塊組織，壓碎后于光學顯微鏡下直接鏡檢。 5組織逆培養(yǎng)各臟

4、器用組織研磨器研碎后挑取少許分別接種于沙堡氏試管培養(yǎng)基、平皿培養(yǎng)基和玻片小培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)三天，觀察菌落的生長情況，然后挑取菌落制成濕片在光學顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。 6組織病理學檢查取各臟器表面肉眼可見病理改變組織，用10％福爾馬林溶液常溫固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，HE和PAS染色，光鏡下觀察組織病理學改變。 7腎臟載菌量(CFU)的測定單側(cè)腎臟用組織研磨器研碎后，加無菌生理鹽水1ml混勻，取10μl組

5、織懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面，37℃溫箱中培養(yǎng)，48小時后讀取平皿表面的菌落數(shù)。 8電鏡掃描電鏡(SEM)觀察林生地霉在組織中的形態(tài)和表現(xiàn)。透射電鏡(TEM)觀察組織超微結(jié)構(gòu)的改變。 結(jié)果：1動物模型腹腔和靜脈注射途徑感染小鼠解剖后肝、脾、腎、心、肺表面可見大小不一白色化膿灶，真菌培養(yǎng)陽性，組織病理學檢查可見大量菌絲和孢子。皮下注射途徑無明顯改變，各臟器真菌培養(yǎng)和組織病理學改變均呈陰性。 2自然死亡情況免疫抑制

6、靜脈組在接種后第3天即出現(xiàn)死亡高峰，死亡率高達100％。免疫抑制腹腔組在接種該菌后3天開始出現(xiàn)死亡，第7天達到高峰，至2周止，死亡率為55.6％。其余各組均無自然死亡。 3大體改變免疫正常腹腔和靜脈組在感染早期少數(shù)幾只小鼠肝臟表面見到針尖至粟粒大小的白色膿灶，其余臟器偶見。免疫抑制腹腔組大多數(shù)小鼠肝臟表面均可見到較多約針尖至粟粒大小的白色膿點或膿灶，自2、3個至30多個不等，其次為肺，但心臟表面未見。免疫抑制靜脈組臟器表面無感染

7、灶。可以見到不同程度的肝脾腫大，呈紫紅色。部分死亡小鼠的肺明顯萎縮，呈粉色或白色。 4直接鏡檢可見大量矩形、桶狀、圓形或橢圓形關(guān)節(jié)孢子，大小不一，有的為厚壁孢子，有時可見出芽現(xiàn)象。 5組織逆培養(yǎng)培養(yǎng)三天后均見同一菌落生長，為表面平坦、濕潤的乳白色酵母樣菌落。 6病理學變化蘇木精-伊紅染色早期表現(xiàn)為急性炎細胞浸潤，可見組織細胞壞死。后期可見慢性化膿性肉芽腫，中央為炎性壞死，其中可見淡染、散在分布的圓形孢子及少量關(guān)節(jié)

8、孢子和菌絲，周邊也可見組織細胞及多核細胞反應性增生，并有纖維性包裹。PAS染色可見紫紅色的菌絲、關(guān)節(jié)孢子及圓形孢子。 7腎臟載菌量(CFU)無論免疫正常還是免疫抑制狀態(tài)下，靜脈注射組腎臟感染程度較腹腔組重，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P＜0.05)；免疫抑制腹腔注射組腎臟感染程度較免疫力正常腹腔注射組重，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P＜0.05)；免疫抑制靜脈注射組腎臟感染程度較免疫力正常靜脈注射組重，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異(P＜

9、0.05)。 8電鏡掃描電鏡下可見組織表面較多粘附或鑲嵌分布的圓形、橢圓形的孢子，偶見炎細胞。透射電鏡下見到嗜酸性粒細胞，未見到真菌孢子和吞噬現(xiàn)象。 結(jié)論：1通過腹腔和靜脈注射途徑可以成功建立林生地霉系統(tǒng)性感染小鼠模型。皮下途徑不能致系統(tǒng)性感染。 2免疫力低下狀態(tài)更易引起感染，感染的程度也更重。但當進入體內(nèi)的菌量較大時也可引起免疫力正常的小鼠的系統(tǒng)性感染，說明此菌具有較強的致病力。 3腹腔途徑給予此菌，各