犬瘟熱病毒對毛皮動物致病性及變異株致病性增強機制的初步研究.pdf

1、犬瘟熱病毒（Canine distemper virus,CDV）感染引起的犬瘟熱（Canine distemper,CD）是一種多種屬動物共患傳染病，不同動物對CDV易感性和致死率不同。因毛皮動物（貉、狐和水貂）是CDV自然易感宿主，該病一直是我國毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的“頭號殺手”。H蛋白為病毒主要保護性抗原蛋白，除在介導病毒毒力、SLAM/Nectin-4受體識別和輔助F蛋白誘導細胞膜融合中發(fā)揮重要作用外，編碼基因的高變異性也使其成為CD

2、V基因分型及遺傳變異研究的主要靶基因。
　　為建立用于病毒動物致病性研究及疫苗免疫效力評價的 CDV毛皮動物致病模型，本研究用我國CDV主要流行基因型（Asia-1型）LN(10)1株實驗感染3組狐貍、貉和水貂（每組5只）。通過設(shè)置評價毒力和免疫抑制指標的賦分系統(tǒng)，建立了CDV感染毛皮動物的致病模型。試驗結(jié)果表明CDV對3種動物致病性（毒力和免疫抑制）差異顯著（P<0.05）：感染貉出現(xiàn)明顯發(fā)熱、結(jié)膜炎等典型CD癥狀和病理變化并于

3、15 dpi內(nèi)100％（5/5）死亡，獲得高致病分數(shù)（2.6和2.9）；狐貍表現(xiàn)出相對溫和的CD癥狀并于21 dpi內(nèi)40%（2/5）死亡，獲得中等致病分數(shù)（2.15和2.25）；而水貂僅顯示溫和CD癥狀并于21 dpi內(nèi)全部存活，獲得低致病分數(shù)（0.9和1.95）。此外，死亡和存活動物IFN-γ和IL-4在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上分別表現(xiàn)下調(diào)和上調(diào)；發(fā)病動物TNF-ɑ轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，表明CDV對動物致病性差異與細胞因子變化具有相關(guān)性。

4、　　為闡明近年來我國毛皮動物CD頻繁暴發(fā)的原因，本研究對2011-2013年來自我國山東、河北、遼寧和黑龍江省16份水貂、狐貍和貉源CDV-H基因序列分析表明：與2012年之前的CDV流行株不同，10株來自山東省的CDV-H蛋白與 SLAM受體的結(jié)合區(qū)（RBS）發(fā)生了I542N和Y549H突變，在系統(tǒng)進化樹上處于Asia-1基因型獨立遺傳分支，我們將其命名為CDV變異株（HI542N/Y549H）。三維結(jié)構(gòu)分析表明Y549H突變改變了H

5、蛋白與水貂SLAM（mSLAM）的分子間作用力，I542N突變導致H蛋白542-544位產(chǎn)生了一個潛在N-連接糖基化位點。通過對CDV-H基因群體進化分析顯示變異株2006年起源于我國毛皮動物，Y549H突變在H基因進化過程中受到選擇壓力影響。該突變株暴發(fā)可能預示著CDV在宿主或免疫壓力下對毛皮動物適應性增強。
　　為評價CDV變異株對毛皮動物致病性和疫苗免疫保護效果，基于我們建立的CDV動物致病模型，本研究對CDV變異株SD(1

6、4)7和經(jīng)典株LN10(1)1進行動物感染試驗。實驗結(jié)果表明CDV變異株對毛皮動物（尤其水貂）毒力（發(fā)熱、死亡率和病理變化等）和誘導免疫抑制（淋巴細胞減少癥、抑制中和抗體和拮抗細胞因子表達等）水平有所增強，但當前疫苗能提供免疫動物對該變異株的攻毒保護。我們通過對2株CDV-H基因542和549位氨基酸人工突變和回復突變、CDV-H蛋白與mSLAM免疫共沉淀及細胞融合試驗，在H蛋白表達、受體親和力和細胞感染水平來探究氨基酸突變對病毒生物學

7、特性的影響。
　　研究結(jié)果表明：
　?。?）I542N突變未使 H蛋白在該位點被糖基化修飾；
　?。?）I542N和Y549H突變降低了H蛋白表達水平但增強了H蛋白與mSLAM相互作用。
　?。?）I542N和Y549H突變未增強CDV-H/F蛋白對表達mSLAM細胞的融合能力。
　　綜上研究表明，近年來我國毛皮動物CD頻繁暴發(fā)可能是由于強毒力CDV變異株的出現(xiàn)，初步揭示了CDV變異株對毛皮動物（尤其水貂）