實驗兔糖尿病性心肌病心臟舒張功能不全CML和Titin的改變及坎地沙坦酯的作用.pdf

1、本研究分成三部分：第一部分，建立1型糖尿病兔模型，通過自身對照，使用心臟彩色多普勒檢測心臟功能變化，了解高糖血癥致心臟功能變化的特點(diǎn)，確定形成糖尿病性心肌病左室舒張功能不全的時間；第二部分，分組對照試驗，探討糖尿病兔在心臟舒張功能不全時CML和心肌titin的變化，及其他常見室壁僵硬度相關(guān)因素改變；第三部分，藥物干預(yù)試驗，在糖尿病兔成模后即予低劑量和高劑量的坎地沙坦酯口服，觀察藥物對糖尿病致心臟舒張功能不全的影響，并探討其作用環(huán)節(jié)。

2、r>　　 第一部分實驗兔糖尿病性心肌病心功能變化特征
　　 一.目的
　　 了解四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型心功能的發(fā)展規(guī)律，確定糖尿病性心肌病出現(xiàn)射血功能正常的心臟舒張功能不全的時間。
　　 二.方法
　　 建立四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型。使用自身對照方法，按時間順序分別在成模前、成模后2周、4周、6周行心臟彩色多普勒檢查，確定各時間段心臟功能的變化特征。統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)。
　　 三.結(jié)果

3、r>　　 心臟多普勒動態(tài)觀察糖尿病兔心臟功能改變：與成模前自身對照，成模后2周各指標(biāo)無明顯改變(P＞0.05)；4周出現(xiàn)E/A比值倒置，EDT延長(P＜0.05)，EF、LVFS無變化(P＞0.05)；6周出現(xiàn)EF、LVFS值下降(P＜0.05)。
　　 四.結(jié)論
　　 四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型可出現(xiàn)心臟功能進(jìn)行性下降，早期表現(xiàn)為舒張功能不全，晚期出現(xiàn)收縮功能下降。成模后4周表現(xiàn)為EF正常的左室舒張功能不全。

4、　　 第二部分實驗兔糖尿病性心肌病心臟舒張功能不全時室壁被動僵硬度相關(guān)因素變化
　　 一.目的
　　 探討四氧嘧啶致1型糖尿病兔心臟舒張功能不全階段，心臟的結(jié)構(gòu)和功能變化特點(diǎn)。分別檢測室壁僵硬度相關(guān)因素：心肌細(xì)胞大小、心肌間質(zhì)纖維化程度、膠原可溶性、CML-AGEs沉積和心肌titin的變化，探討糖尿病性心肌病舒張功能不全的發(fā)生機(jī)制。
　　 二.方法
　　 1、實驗分組：非對稱地隨機(jī)分為對照組(C組)1

5、0只，糖尿病組(D組)15只。
　　 2、成模后4周行心臟彩色多普勒檢查和左室導(dǎo)管并多巴酚丁胺負(fù)荷實驗，檢測心臟功能。
　　 3、采集血標(biāo)本測定一般生化指標(biāo)，放射免疫法測定血漿血管緊張素Ⅱ和醛固酮水平。
　　 4、采集心肌標(biāo)本分別行：
　　 (1)病理檢查：HE染色，測量心肌細(xì)胞橫切面積(cross-sectiona1 area,CSA)；Masson染色，計算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume

6、 fraction,CVF)；透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 (2)放射免疫法測定心肌組織血管緊張素Ⅱ水平。
　　 (3)酸水解法測羥脯氨酸，計算心肌可溶性膠原纖維比例。
　　 (4)免疫組化定量測定CML-AGEs沉積。
　　 (5)titin檢測：real time PCR法定量測定總titin、titin N2B和titin N2BA的mRNA表達(dá)；垂直電泳并染色測定總titin、titin N2

7、B和titin N2BA的蛋白表達(dá)。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)。
　　 三.結(jié)果
　　 1、左心功能評價：
　　 (1)心臟多普勒結(jié)果：糖尿病組與正常組相比E/A比值倒置，EDT延長(P＜0.05)，EF、LVFS無變化(P＞0.05)。
　　 (2)血流動力學(xué)結(jié)果：糖尿病組與正常組相比LVEDP和T值升高，LV-dp/dtmax降低(P＜0.05)；LVSP、LV+dp/dtmax無明顯變化

8、(P＞0.05)。
　　 (3)多巴酚丁胺負(fù)荷實驗：正常組在多巴酚丁胺刺激下隨劑量增多，LV±dp/dtmax均增強(qiáng)，尤以收縮功能增強(qiáng)為主；糖尿病組在中等劑量的多巴酚丁胺刺激下已開始出現(xiàn)LV+dp/dtmax下降，LV-dp/dtmax無改善。
　　 2、左心形態(tài)學(xué)改變：
　　 (1)大體形態(tài)學(xué)改變：糖尿病組與正常組相比，心臟多普勒檢測左室各室壁厚度及室腔大小無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，左心室重量指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差

9、異(P＞0.05)。
　　 (2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：與正常組相比，糖尿病組HE染色無心肌肥大表現(xiàn)，心肌細(xì)胞直徑無統(tǒng)計學(xué)差異；透射電鏡檢測可見糖尿病組少量肌絲呈局灶性溶解，部分線粒體腫脹、空泡化，肌纖維間脂滴堆積。
　　 3、心肌間質(zhì)膠原纖維改變：
　　 (1)膠原纖維含量測定：Masson染色顯示糖尿病組與正常組相比膠原含量稍增多，但CVF無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 (2)膠原纖維可溶性測定：糖尿病組與正常組相比

10、可溶性膠原纖維含量明顯下降(P＜0.05)。
　　 4、CML-AGEs免疫組化定量檢測：糖尿病組與正常組相比細(xì)胞間質(zhì)CML沉積數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。CML平均光密度值(mean density,score/mm2)與血流動力學(xué)指標(biāo)T呈線性相關(guān)關(guān)系(r=0.797，P＜0.05)。
　　 5、心肌titin的改變
　　 (1)蛋白定量檢測：糖尿病組與正常組相比，總titin量和N2B/N2BA無統(tǒng)計學(xué)差異

11、(P＞0.05)。
　　 (2) mRNA定量檢測：糖尿病組與正常組相比，總titin、titin N2B、titinN2BA的mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05)。
　　 四.結(jié)論
　　 1、四氧嘧啶致1型糖尿病兔可呈糖尿病性心肌病病理改變，成模后4周表現(xiàn)為左室射血功能保留的舒張功能不全。
　　 2、CML-AGEs增多與糖尿病性心肌病早期心臟舒張功能不全相關(guān)。
　　 3、在糖尿病性心肌病早期

12、舒張功能不全階段，titin轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，但蛋白總量和亞型比例無明顯變化。
　　 第三部分坎地沙坦酯對糖尿病兔心臟舒張功能不全影響
　　 一.目的
　　 研究坎地沙坦酯對實驗性兔糖尿病性心肌病舒張功能不全的影響及其作用環(huán)節(jié)。
　　 二.方法
　　 1、建立四氧嘧啶致1型糖尿病兔模型。
　　 2、隨機(jī)分組：糖尿病坎地沙坦低劑量組(簡稱低劑量藥物組，DLA組)15只和糖尿病坎地沙坦高劑量組(簡稱高

13、劑量藥物組，DHA組)15只。在成模后3天開始給予坎地沙坦酯口服，口服劑量：DLA組1mg/kg/d，DHA組5mg/kg/d。
　　 3、成模后4周行心臟功能檢測，血標(biāo)本檢測和心肌標(biāo)本檢測，檢測指標(biāo)和方法同第二部分。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)，正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組四組間采用單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)。若方差分析有統(tǒng)計學(xué)意義，采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較。

14、
　　 三.結(jié)果
　　 1、左心功能評價：
　　 (1)心臟多普勒結(jié)果：兩藥物組比較各指標(biāo)無明顯差異(P＞0.05)。兩藥物組與糖尿病組相比均表現(xiàn)為E值升高，A值下降，E/A倒置逆轉(zhuǎn)，EDT延長縮短(P＜0.05)。與正常組相比仍有E值下降，A值升高，E/A比值降低，EDT延長(P＜0.05)。
　　 (2)血流動力學(xué)結(jié)果：DHA組血壓明顯下降(P＜0.05)，其余指標(biāo)兩藥物組間無明顯差異(P＞0.05)

15、。兩藥物組與糖尿病組相比LVEDP降低，LV-dp/dtmax和T值較前改善(P＜0.05)。與正常組相比上述指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 (3)多巴酚丁胺負(fù)荷實驗：DLA組隨多巴酚丁胺劑量增多LV±dp/dtmax有增強(qiáng)；DHA組隨多巴酚丁胺劑量增多LV±dp/dtmax無變化。
　　 2、左心形態(tài)學(xué)改變：
　　 (1)大體形態(tài)學(xué)改變：四組間比較心臟多普勒檢測左室各室壁厚度及室腔大小無統(tǒng)計學(xué)差異(P

16、＞0.05)，左心室重量指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 (2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：四組間比較心肌細(xì)胞直徑無統(tǒng)計學(xué)差異；透射電鏡檢測DLA組和DHA組肌絲與線粒體改變與糖尿病組相似，但肌纖維間脂滴堆積較糖尿病組明顯減少。
　　 3、心肌間質(zhì)膠原纖維改變：
　　 (1)膠原纖維含量測定：正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組的CVF(％)分別為：4.7±1.2，5.9±1.3，5.2±2.1，5.3±1.8(P＞

17、0.05)，無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 (2)膠原纖維可溶性測定：正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組的的心肌組織可溶性膠原纖維含量(％)分別為：50.22±2.99，40.43±2.75，46.08±3.05，48.54±3.04(P＜0.05)。兩藥物組間無統(tǒng)計學(xué)差異。兩藥物組可溶性膠原纖維含量均較糖尿病組升高，具統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4、糖基化終產(chǎn)物CML免疫組化定量檢測：正常組、糖尿病組、DLA組和DHA組的平均光密度值

18、(mean density,score/mm2)分別為：15.59±1.88，40.89±3.01，29.52±4.22，24.8±2.97(P＜0.05)。兩藥物組間無統(tǒng)計學(xué)差異。兩藥物組CML較糖尿病組明顯減少，具統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5、心肌肌聯(lián)蛋白titin的改變
　　 (1)蛋白定量檢測：四組間比較總titin和N2B/N2BA亞型比值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)
　　 (2) mRNA定量檢測：兩藥物組