卡維地洛對糖尿病心肌病的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、近年來，糖尿病的發(fā)病率明顯上升，糖尿病心肌?。╠iab eticcardiomyopathy,DCM）作為一個獨(dú)立于冠心病、心臟瓣膜病、高血壓病性心臟病的臨床疾病，主要表現(xiàn)為心肌收縮和舒張功能異常。目前DCM的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要與心肌能量代謝紊亂、炎癥、氧化應(yīng)激、鈣離子超載、細(xì)胞凋亡有關(guān)，而其主要的病理表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、心室質(zhì)量/體質(zhì)量（心重指數(shù)）增加、心肌間質(zhì)重構(gòu)及心肌纖維化。Firodaliso等研究表明，鏈脲

2、佐菌素（Streptozotocin,STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠早期（3天）即可出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，因此認(rèn)為氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化可能在DCM心室重塑及心力衰竭中起著十分重要的作用。和細(xì)胞增殖一樣，細(xì)胞凋亡也是受基因調(diào)控的精確過程。目前細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一是通過細(xì)胞膜上的死亡受體激活天冬氨酸蛋白水解酶（cys teinylasp artate spec ificp ro teinase,casp ase），而另一條途

3、徑是通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體途徑釋放細(xì)胞因子，細(xì)胞因子可激活caspase，降解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，caspase-3作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，在各種因素啟動的凋亡程序中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，是參與凋亡的caspase級聯(lián)反應(yīng)的最終效應(yīng)因子，抑制caspase-3的活性或功能可抑制細(xì)胞凋亡。
　　AKT也稱蛋白激酶B（protein kinaseB,PKB），可誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，通過上調(diào)抗凋亡基因和下調(diào)凋亡

4、基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)對細(xì)胞凋亡的抑制，促進(jìn)細(xì)胞存活。在新發(fā)現(xiàn)的抗凋亡蛋白家族中，X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitorof apoptosis protein,XIAP）蛋白是目前已知最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可直接抑制casp ase從而的保護(hù)細(xì)胞免受各種凋亡刺激。而AKT能夠磷酸化XIAP的Ser87位點(diǎn)，使其免于被泛素化及降解，穩(wěn)定在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，起到抑制凋亡作用。
　　銜接蛋白p66s hc可參與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激

5、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧ROS的產(chǎn)生并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。諸多研究表明，p66s hc參與了心血管疾病、糖尿病等疾病的發(fā)生、發(fā)展。另外，p66s hc的磷酸化是由體內(nèi)PKCβ的激活調(diào)節(jié)的。PKCβ/p66shc信號通路參與小腸缺血再灌注損傷介導(dǎo)的多臟器損傷的病理生理過程。
　　卡維地洛作為第三代?-受體阻滯劑，既能阻滯β1、β2受體，還能阻滯α1受體，同時具有抗氧化、清除氧自由基、減輕心室重構(gòu)、抑制心肌纖維化、抑制細(xì)胞凋亡的作

6、用?？ňS地洛對糖尿病心肌病患者可能具有保護(hù)作用，其具體機(jī)制尚未完全闡明，可能與細(xì)胞內(nèi)多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。為證明該假設(shè)，本研究:
　　1）臨床觀察卡維地洛對糖尿病心肌病患者的療效；
　　2）應(yīng)用糖尿病心肌病大鼠動物模型，和體外高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞模型，觀察卡維地洛對心肌炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、膠原代謝、AKT/XIAP信號通路及PKCβ/p66s hc線粒體氧化應(yīng)激信號通路等的影響，為治療糖尿病心肌病提供新的理論基礎(chǔ)和實驗

7、依據(jù)。
　　第一部分：卡維地洛對糖尿病心肌病患者代謝、炎癥反應(yīng)及心功能的影響
　　目的：
　　卡維地洛對糖尿病心肌病患者心功能的影響及機(jī)制
　　方法：
　　選擇2014年9月至2016年9月于唐山市工人醫(yī)院心內(nèi)科及內(nèi)分泌科收治的糖尿病心肌病患者共90例，均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性50例，女性40例，年齡35-65歲，平均年齡45.6歲，采用簡單隨機(jī)化方法隨機(jī)分為卡維地洛治療組（n=50例）和對照組（n=40例

8、）。對照組采用常規(guī)治療，卡維地洛治療組在對照組用藥的基礎(chǔ)上加用卡維地洛（達(dá)力全，羅氏制藥）3.125 mg2/日口服2周，2周后如果無明顯的心衰加重表現(xiàn)，改為6.25 mg2/日口服，繼續(xù)口服2周，如仍無心衰加重表現(xiàn)，再繼續(xù)口服8周。兩組在開始治療前及治療后12周，應(yīng)用ELISA法分別檢測血清hsCRP、TNF-α、NT-proBNP(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide,氨基末端B型腦鈉肽

9、前體)、空腹血糖、總膽固醇及甘油三酯水平，應(yīng)用心臟超聲檢測左室舒張末期（LVEDd）及收縮末期內(nèi)徑（LVEDs）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），通過6分鐘步行距離實驗來評定患者的運(yùn)動耐力。
　　結(jié)果：
　　1.生化指標(biāo)的改變：兩組治療前后相比：空腹血糖、總膽固醇及甘油三酯水平無顯著差異（P>0.05），且卡維地洛治療12周后，治療組與對照組相比上述生化指標(biāo)仍無顯著差異（P>0.05）。
　　2.心臟功能的變化：兩組治療后左

10、室舒張末期內(nèi)徑、收縮末期內(nèi)徑、NT-proBNP水平均較治療前明顯減低（P<0.05），且治療組與對照組相比減低更顯著（P<0.05）；兩組左室射血分?jǐn)?shù)均較治療前顯著升高（P<0.05），且治療組與對照組相比升高更明顯（P<0.05）?？ňS地洛治療組6分鐘步行距離（577.40±80.13）m,較治療前（292.95±34.12）m有所改善（P<0.05），與對照組（456.32±30.09） m相比有顯著差異（P<0.05），對照組自

11、身治療前后對比6分鐘步行距離也有顯著差異（296.68±21.79）mvs（456.32±30.09）m（P<0.05）。
　　3.炎癥指標(biāo)的改變：兩組治療前后相比血清hsCRP、TNF-α水平明顯減低（p<0.05），且治療組與對照組相比減低更顯著（P<0.05）；
　　結(jié)論：
　　卡維地洛應(yīng)用于糖尿病心肌病患者可以顯著改善患者心臟收縮與舒張功能，提高患者的活動耐量，不影響患者血糖及血脂水平，其治療作用可能與卡維地洛

12、能夠減輕心肌炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激、抑制心室重構(gòu)及細(xì)胞凋亡、減輕心肌纖維化有關(guān)；
　　第二部分：AKT/XIAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病心肌病大鼠心肌病變中的表達(dá)及卡維地洛的干預(yù)研究
　　目的：
　　研究卡維地洛對糖尿病心肌病大鼠AKT/XIAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　方法：
　　采用成年雄性Wistar SD大鼠，通過高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法，制成2型糖尿病心肌病大鼠模型。12周

13、后分成低劑量卡維地洛組（1mg/kg/d）、高劑量卡維地洛組（10mg/kg/d）,應(yīng)用上述藥物每天給大鼠灌胃一次，健康對照組及模型組每天給予相同劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周后，處死取材。超聲心動圖檢測左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVEDs）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。通過應(yīng)用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡分別觀察健康對照組、糖尿病組大鼠心臟的組織形態(tài)學(xué)改變，從而確定糖尿病心肌病模型建立情況以及心肌炎癥浸潤程度；通過

14、生化法檢測血清 IL-1β、TNF-ɑ、空腹血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）及NT-proBNP的含量以確定心肌的炎癥反應(yīng)及代謝、心功能方面的改變；用T UNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況；用Mass o n及Viment in染色了解心肌纖維化情況；應(yīng)用免疫組化方法檢測caspase-3的表達(dá)；應(yīng)用Western bolt技術(shù)檢測AKT、p-AKT、XIAP、p-XIAP、c asp as e-3及I型膠原蛋白(Co llgen

15、 I)的表達(dá)。
　　體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，分為正常對照組（NC，5.5mmol/LD-葡萄糖）,高糖組（HG,33mmol/LD-葡萄糖），高糖+卡維地洛組（HG+Carv,33mmol/L D-葡萄糖+10μmol/L卡維地洛），應(yīng)用Western bolt技術(shù)檢測AKT、p-AKT、XIAP、p-XIAP、IL-1β、TNF-ɑ、Collgen I及caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠的一般

16、情況比較：健康對照組（NC組）大鼠毛發(fā)光澤，精神狀態(tài)、進(jìn)食水情況及活動度均較好，糖尿病模型組（DM組）大鼠通過高糖高脂飲食的喂養(yǎng)體重明顯增加，喂養(yǎng)到4周時，體重已明顯高于對照組。4周時給予腹腔內(nèi)一次性注射鏈脲佐菌素（STZ），給藥2周后，DM組大鼠體重開始下降，但在實驗結(jié)束時仍明顯高于Co ntro l組，但卡維地洛（Carv）治療組大鼠體重較 DM組顯著增加（P<0.05），但仍明顯低于NC組。高劑量卡維地洛（CarvH）組較低劑量組

17、（CarvL）相比無顯著差異（P>0.05）；DM組大鼠應(yīng)用STZ后1周即出現(xiàn)多飲多食、多尿的癥狀，并且逐漸加重，同時出現(xiàn)毛發(fā)變得灰黃、精神萎靡、活動度差的表現(xiàn)。Carv組與DM組相比上述癥狀無明顯改善；DM組大鼠心臟質(zhì)量/體質(zhì)量（HW/BW）明顯高于NC組（P<0.05），Carv治療組與 DM組相比（HW/BW）明顯減低（P<0.05），且CarvH組與CarvL組相比差異更明顯（P<0.05）。
　　2.大鼠的心肌組織病理學(xué)

18、改變：電鏡觀察：NC組心肌細(xì)胞肌節(jié)結(jié)構(gòu)（明帶、暗帶、Z線、M線）清晰可見，細(xì)胞連接閏盤結(jié)構(gòu)清楚，肌束間線粒體縱行排列且膜結(jié)構(gòu)完整；DM組部分肌絲、肌節(jié)溶解、斷裂，閏盤間隙消失，線粒體腫脹、部分消失、部分固縮，心肌間質(zhì)膠原沉積、毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹；Carv組心肌組織改變介于DM組和NC組之間，心肌病變較 DM組明顯減輕，間質(zhì)膠原沉積較少，毛細(xì)血管基底膜增厚減輕。HE染色：切片上可見DM組大鼠心肌細(xì)胞肥大且不規(guī)則、細(xì)胞排列紊亂、心肌細(xì)胞間質(zhì)及

19、細(xì)胞外基質(zhì)增多、成纖維細(xì)胞增多；NC組：大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、可見少量成纖維細(xì)胞、結(jié)構(gòu)清晰；Carv組心肌細(xì)胞較 DM組排列更規(guī)則，肌纖維變性較輕，纖維組織增生明顯減少。通過電鏡及HE染色觀察DM組大鼠糖尿病心肌病模型成功建立。
　　3.大鼠心功能的改變：實驗?zāi)cNC組相比，DM組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）均明顯增加（P<0.05）， EF值明顯下降（P<0.05）；而Carv低、高劑量預(yù)

20、處理后LVIDd、LVIDs均明顯降低（P<0.05），EF值明顯升高（P<0.05），差異顯著；Carv高劑量組與低劑量組相比LVIDd、LVI Ds數(shù)值均有所減低，EF有所升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與NC組相比，DM組大鼠血漿NT-proBNP水平較顯著升高（P<0.05）；Carv低、高劑量預(yù)處理后血漿NT-proBNP水平明顯下降（P<0.05）且 Carv高劑量與低劑量相比血漿NT-proBNP水平下降更明顯

21、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.生化指標(biāo)的改變：與NC組相比，DM組大鼠IL-1β、TNF-ɑ表達(dá)水平均增加（P<0.05）而予以Carv低、高劑量預(yù)處理后，治療組上述兩種指標(biāo)表達(dá)水平均明顯減低（P<0.05），且高劑量組減低更明顯,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與NC組相比，DM組大鼠空腹血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）水平均明顯升高（P<0.05）。但Carv低、高劑量組與DM組三組空腹血糖、T

22、G、TC水平無顯著差別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　5.大鼠心肌細(xì)胞凋亡的改變：正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，T UNEL染色凋亡陽性心肌細(xì)胞核呈棕黃色，在光鏡下計數(shù)5個高倍視野中凋亡陽性心肌細(xì)胞核數(shù)目及占總細(xì)胞核數(shù)目的比例，求其均值得出細(xì)胞凋亡陽性指數(shù)AI（Apoptosis Index）。與NC組相比，DM組AI數(shù)值明顯升高，Carv低、高劑量組與DM組相比AI數(shù)值均明顯下降且Carv高劑量組較Carv低劑量組相比下降更明

23、顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Western Bolt結(jié)果顯示：與NC組相比，DM組大鼠caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯升高，Carv低、高劑量藥物干預(yù)后caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯下降，且Carv高劑量組較Carv低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化顯示：c asp as e-3以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。與NC組相比，DM組大鼠

24、陽性染色光密度積分明顯增高，Carv低、高劑量藥物干預(yù)后caspase-3陽性染色細(xì)胞數(shù)明顯下降，且Carv高劑量組較Carv低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.大鼠心肌組織膠原的變化：Mas son染色結(jié)果：NC組大鼠心肌細(xì)胞之間、血管周圍有少量膠原纖維；DM組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增生明顯、排列紊亂、微血管纖維化明顯，膠原纖維呈紅色分布不均、相互連接成網(wǎng)狀；Carv低、高劑量預(yù)處理后大鼠心肌膠原纖

25、維增生均明顯減輕，且Carv高劑量組膠原纖維增生減輕更明顯，更接近于NC組。Mas so n染色心肌膠原分?jǐn)?shù)（CVF1）:與NC組相比，DM組CVF1數(shù)值明顯升高，Carv低、高劑量預(yù)處理后CVF1數(shù)值明顯下降，且Carv高劑量組與低劑量組相比CVF1數(shù)值下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Vimentin染色及Western Blot結(jié)果顯示：與NC組相比，DM組大鼠I型膠原蛋白的表達(dá)較NC組明顯增加（P<0.05），I

26、型膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）數(shù)值明顯升高，Carv干預(yù)后I型膠原蛋白的表達(dá)明顯下降，CVF也明顯減低，且Carv高劑量組較低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.Western Bolt結(jié)果顯示：與NC組相比p-AKT、p-XIAP蛋白在DM組中表達(dá)明顯下降（P<0.05），Carv干預(yù)后上述兩者水平明顯升高（P<0.05），且 Carv高劑量組較低劑量組升高更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但

27、是 AKT及 XIAP水平在四組的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。
　　8.Western Bolt結(jié)果顯示：與 NC組相比, HG組 H9C2心肌細(xì)胞caspase-3、TNF-α、I型膠原蛋白及IL-1β的表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05），Carv藥物干預(yù)后上述蛋白的表達(dá)水平均明顯下降（P<0.05）；與NC組相比，p-AKT、p-XIAP蛋白在HG組中表達(dá)明顯下降，Carv藥物干預(yù)后上述兩者的表達(dá)水平均明顯升高，差異均具有

28、統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但是AKT及XIAP水平在三組的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。其結(jié)果與體內(nèi)模型的結(jié)果相似。
　　結(jié)論：
　　卡維地洛能夠促進(jìn)AKT及XIAP的磷酸化，減輕糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、抑制心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化、改善心臟功能。
　　第三部分：PKCβ/P66 shc氧化應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病心肌病大鼠心肌病變中的表達(dá)及卡維地洛的干預(yù)研究
　　目的：
　　研究卡維地洛對糖

29、尿病心肌病大鼠PKCβ/p66s hc線粒體氧化應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。、
　　方法：
　　大鼠血漿丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物顯色分光光度比色法。超氧化物歧化酶（SOD）采用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)顯色分光光度比色法測定；應(yīng)用Western bolt技術(shù)檢測大鼠心肌p-PKCβ1、PKCβ1、p-PKCβ2、PKCβ2、p-p66shc、p66shc、caspase-3蛋白的表達(dá)。體外高糖環(huán)境培養(yǎng) H9C2心肌細(xì)

30、胞，模擬體內(nèi)模型，同第二部分，應(yīng)用Western bolt技術(shù)檢測p-PKCβ1、PKCβ1、p-PKCβ2、PKCβ2、p-p66shc、p66shc及caspase-3蛋白的表達(dá)，應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)檢測線粒體活性氧簇（ROS）的表達(dá)水平以及p-p66shc在線粒體內(nèi)的轉(zhuǎn)位率。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠癥狀體征、生化指標(biāo)的改變：HE染色、Mass o n染色、電鏡對超微結(jié)構(gòu)改變的觀察均同第二部分。
　　2.丙二醛（M

31、DA）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測結(jié)果：體內(nèi)實驗結(jié)果表明，與NC組相比，DM組大鼠MDA水平明顯升高，SOD水平明顯減低（P<0.05）；與DM組相比卡維地洛治療后MDA水平明顯降低、SOD水平顯著升高（P<0.05），且CarvH與CarvL組相比上述改變更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。體外高糖環(huán)境培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞的結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果相一致。
　　3.Western bolt顯示：與NC組相比，DM大鼠p-PK

32、Cβ2、p-p66shc及caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05）,Carv低、高劑量預(yù)處理后上述指標(biāo)均明顯下降（P<0.05），且Carv高劑量組較低劑量組下降更明顯，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。但是 p-PKCβ1、PKCβ1水平在四組的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。體外高糖環(huán)境培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞的結(jié)果與體內(nèi)實驗結(jié)果相似。
　　4.體外實驗結(jié)果：激光共聚焦結(jié)果顯示與NC組相比，HG組線粒體ROS生