高氧致CLD早產(chǎn)鼠p16基因啟動(dòng)子甲基化及其對(duì)肺纖維化作用的研究.pdf

1、早產(chǎn)兒慢性肺疾病(CLD)是早產(chǎn)兒長時(shí)間吸入高濃度氧、機(jī)械通氣治療或感染后的最常見并發(fā)癥。盡管其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，但早期的肺泡上皮損傷及晚期不可逆的肺間質(zhì)纖維化的病理結(jié)局已被公認(rèn)。近年來，隨著極低出生體重兒的存活率明顯提高，CLD的發(fā)生率也在逐年增加，現(xiàn)已成為威脅早產(chǎn)兒健康和生命的首要疾病。雖然CLD的病因復(fù)雜，但長時(shí)間吸入高濃度氧氣目前被學(xué)者們認(rèn)為是早產(chǎn)兒CLD發(fā)生的最主要原因及最危險(xiǎn)因素。因此，探索高氧致早產(chǎn)兒CLD肺纖維化的發(fā)生機(jī)

2、制是國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)問題。
　　 早產(chǎn)兒CLD的主要病理變化是肺成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積及肺組織的纖維化。目前有關(guān)其發(fā)病機(jī)理的研究多集中在如下幾個(gè)方面：(1)因早產(chǎn)兒肺組織的抗氧化能力尚不成熟(如超氧化物岐化酶等缺乏)，當(dāng)長時(shí)間吸入高濃度氧后，大量的氧自由基生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷。(2)細(xì)胞因子作用的結(jié)果。越來越多的證據(jù)表明，CLD的發(fā)生與多種細(xì)胞因子的協(xié)調(diào)作用密切相關(guān)。其中涉及促炎和促纖維化的細(xì)胞因子包括：IL-1

3、、IL-6、IL-8、TNF-α等，這些物質(zhì)引起炎癥反應(yīng)過程，募集并刺激炎癥細(xì)胞。另外，IL4、IL-10、TGF-β1、VEGF等細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎、促纖維化及調(diào)節(jié)新生血管形成的作用。(3)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)動(dòng)態(tài)平衡的破壞也參與了CLD的發(fā)生?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一個(gè)蛋白水解酶家族，主要作用降解細(xì)胞外基質(zhì)，在肺發(fā)育過程中起重要作用。膠原酶MMP-1和MMP-8降解Ⅰ型膠原(細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)蛋白)，明膠酶MMP-2、MMP-

4、9降解Ⅳ型膠原(肺基底膜的主要成分)。金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)調(diào)節(jié)了MMPs的活性。若上述MMPs表達(dá)水平減少或TIMPs表達(dá)增加都可使ECM沉積而發(fā)生纖維化。
　　 p16基因又稱多腫瘤抑制基因，最早是作為一重要的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)的，直接作用于細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞的增殖，目前被認(rèn)為是重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子。近年來已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究。在腫瘤的研究中已發(fā)現(xiàn)，p16基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化異常對(duì)其基因表達(dá)有明顯的抑制

5、作用，可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而引起相應(yīng)表達(dá)基因的沉默。大量的研究資料結(jié)果表明，因p16基因的啟動(dòng)子甲基化而引發(fā)的p16失活與多種惡性腫瘤、腸上皮化生、銀屑病、燒傷后瘢痕的形成及衰老的發(fā)生等等密切相關(guān)。那么在早產(chǎn)兒CLD的發(fā)生中，因肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞異常增殖而導(dǎo)致的肺纖維化是否與上述疾病有類似的基因調(diào)控過程，尚有待于研究和闡明。
　　 故本研究將在我們以往研究的基礎(chǔ)上，以高氧誘導(dǎo)的早產(chǎn)鼠CLD模型和分離培養(yǎng)的肺間質(zhì)的成纖維細(xì)

6、胞為研究對(duì)象，從組織學(xué)、細(xì)胞和分子的水平，研究p16基因在CLD肺纖維化中作用機(jī)制，從新的角度探索早產(chǎn)兒肺纖維化的發(fā)生機(jī)制，從而為重新設(shè)計(jì)CLD的有效防治途徑尋找新的突破口。
　　 實(shí)驗(yàn)材料及方法：
　　 一、動(dòng)物模型制備
　　 本實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。實(shí)驗(yàn)組將剖宮取出的早產(chǎn)Wistar大鼠(連同母鼠)生后立即置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持FiO2為0.90(用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè))，CO2濃度＜0.

7、5％(用鈉石灰吸收CO2)，溫度25℃～27℃，濕度50％～70％，每24 h定時(shí)開箱30 min，添加水、飼料及更換墊料，并與對(duì)照組交換母鼠以避免其因氧中毒致喂養(yǎng)能力下降。對(duì)照組FiO2為0.21，具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同實(shí)驗(yàn)組。
　　 二、標(biāo)本采集和處理
　　 每組分別于實(shí)驗(yàn)后3，7，14和21d隨機(jī)選取10只Wistar早產(chǎn)鼠麻醉(5％水合氯醛0.6ml/100mg)后處死，將左肺組織置于4％多聚甲醛中固定，石蠟包

8、埋，常規(guī)制備5μm組織切片。右肺組織置于無Rnase的Eppendorf管中，-80℃凍存，用于其他指標(biāo)檢測(cè)。
　　 三、肺成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 分別于實(shí)驗(yàn)后3，7，14和21d隨機(jī)選取Wistar早產(chǎn)鼠6只，經(jīng)5％水合氯醛(0.6ml/100mg)腹腔麻醉后處死，無菌條件下迅速取肺，采用胰酶消化、離心、反復(fù)貼壁法，分離純化早產(chǎn)鼠肺成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，經(jīng)波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒定，按1∶2或3

9、接種傳代，取第三代肺成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 四、實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo)
　　 (一)肺形態(tài)學(xué)觀察：切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下動(dòng)態(tài)觀察肺組織的病理改變及進(jìn)行肺組織纖維化程度的判定。
　　 (二)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)肺組織Ⅰ型膠原的含量。
　　 (三)免疫組化法及Western-blot技術(shù)觀察和檢測(cè)肺組織p16蛋白的表達(dá)狀態(tài)及水平。
　　 (四)MSP和半巢式PCR檢測(cè)肺組織p16

10、基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。
　　 (五)半巢式PCR檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞的p16基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。
　　 (六)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織和肺成纖維細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)水平。
　　 (七)免疫組化法觀察肺成纖維細(xì)胞p16、PCNA的蛋白表達(dá)。
　　 (八)MTT法觀察肺成纖維細(xì)胞生長活力。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSSll.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用

11、t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman,采用Logistic回歸法求OR值(比值比)，分析關(guān)聯(lián)度。顯著性檢驗(yàn)水平為0.05。
　　 結(jié)論；
　　 1、暴露高氧中早產(chǎn)鼠，其肺組織的p16 mRNA及蛋白的表達(dá)水平降低，其低水平的表達(dá)狀態(tài)與高氧致CLD肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 2、高氧可導(dǎo)致早產(chǎn)鼠的肺組織p16基因啟動(dòng)子的甲基化異常，且其甲基化的發(fā)生率隨高氧暴露時(shí)間的延長而逐漸增加。
　　 3、高氧誘導(dǎo)