高氧致CLD早產(chǎn)鼠肺細(xì)胞凋亡、增殖和間質(zhì)纖維化的動(dòng)態(tài)變化及其機(jī)制研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文高氧致CLD早產(chǎn)鼠肺細(xì)胞凋亡、增殖和間質(zhì)纖維化的動(dòng)態(tài)變化及其機(jī)制研究姓名：富建華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：薛辛東20040301細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)效應(yīng)及其細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制；并試圖闡明C L D 肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制。從而為完善早產(chǎn)兒C L D 的發(fā)生機(jī)制及尋求有效的防治途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法一、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)組將早產(chǎn)的S D 大鼠( 連同代母鼠) 生后即置于氧箱中，持續(xù)輸入氧氣，維持F i O

2、：為0 ．9 0 ( 美國O M - 2 5 M E 型測氧儀監(jiān)測) ，用鈉石灰吸收C O ：，使其濃度< 0 ．5 ％( D a p e x 氣體分析儀) ，溫度2 2 ℃～2 5 。C ，濕度5 0 ％～7 0 ％，每天定時(shí)開箱0 ．5 h ，添加水、飼料及更換墊料，并與對(duì)照組交換母鼠以避免因氧中毒而致喂養(yǎng)能力下降。對(duì)照組F i O ：為0 ．2 1 ( 即空氣) ，具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同實(shí)驗(yàn)組。二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理分別于

3、實(shí)驗(yàn)后的1 d 、3 d 、7 d 、1 4 d 和2 1 d 隨機(jī)處死后分離肺組織。用于肺形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)、原位雜交及脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記( T U N E L ) 檢測的標(biāo)本置于4 ％多聚甲醛中固定；用于超微結(jié)構(gòu)觀察的標(biāo)本置于2 ．5 ％戊二醛中固定；用于酶聯(lián)免疫吸附法( e n —z y m el i n k e di m m u n o a d s o r b e n t ，E L I S A

4、) 和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( r e v e r s et r a n —s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T —P C R ) 檢測的標(biāo)本置于E p p e n d o r f 管中，于- 8 0 ℃冰箱中凍存。三、實(shí)驗(yàn)方法及檢測指標(biāo)1 ．肺形態(tài)的研究1 ) 光鏡下觀察：①觀察肺組織的病理變化；②放射狀肺泡計(jì)數(shù)( r a d i c a la

5、l v e o l a rc o u n t s ，R A C ) ；③肺泡面穢肺間隔面積( A ／S ) ( 美國U n i v e r s a lI m a —g i n gP o r p o r a t i o n 圖像分析系統(tǒng)) ④觀察肺組織內(nèi)的膠原沉積( V G 染色) 。2 ) 透射電鏡下：觀察A E C - Ⅱ表面微絨毛( M v ) 、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體( M i )及板層小體( L B ) 變化。2 ．肺細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研