ShRNA介導(dǎo)的AFP基因沉默對肝癌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)，是一種重要的胚胎期及肝癌相關(guān)蛋白，正常情況下新生兒出生后，AFP表達(dá)即被關(guān)閉。但當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變或發(fā)生化學(xué)或物理損傷時，AFP基因又可重新表達(dá)。目前AFP己成為重要的肝癌臨床檢測標(biāo)準(zhǔn)之一，但對于其在肝癌組織中生理功能，特別是對肝癌細(xì)胞增殖的影響尚不十分清楚。 RNAi是一種生物抵抗病毒的古老的自然機(jī)制，借助雙鏈RNA(dsRNA)分子在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使

2、其沉默，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。在哺乳動物中，可通過21-25bp的小RNA(siRNA)介導(dǎo)相應(yīng)的特異性基因沉默。自1998年RNAi技術(shù)報道以來，由于其高效性和高度特異性，受到生命科學(xué)工作者的重視，越來越廣泛地被應(yīng)用在人類功能基因組學(xué)、特定基因功能分析以及基因治療等方面的研究。 本研究旨在通過載體法RNAi技術(shù)對甲胎蛋白在肝癌HepG2細(xì)胞增殖中的作用進(jìn)行初步的探討，為進(jìn)一步闡明甲胎蛋白在肝癌發(fā)生中的作用提供一定的

3、理論基礎(chǔ)。在研究中我們針對甲胎蛋白編碼區(qū)，構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體siSTRIKE-AFP，通過酶切、瓊脂糖凝膠電泳及測序?qū)|(zhì)粒加以驗證后，利用其對肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，成功沉默AFP基因，進(jìn)而利用流式細(xì)胞術(shù)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，結(jié)果表明沉默AFP基因的HepG2細(xì)胞較正常HepG2細(xì)胞的G1期細(xì)胞百分率明顯升高(P＜0.05)，而G2/M期和S期明顯降低(P＜0.05)，即細(xì)胞分裂被阻滯在G1期。由于細(xì)胞G2/M期和S期

4、細(xì)胞百分率是細(xì)胞增殖的重要參數(shù)，因此通過沉默AFP基因的HepG2細(xì)胞G2/M期和S期細(xì)胞百分率顯著降低可以初步認(rèn)為AFP對HepG2細(xì)胞自身增殖具有一定的促進(jìn)作用。隨后進(jìn)行的檢測細(xì)胞增殖的MTT實驗也支持了上述結(jié)論。 本文涉及的實驗方法包括生物信息學(xué)分析(即針對AFP的shRNA靶序列的設(shè)計和比對以及PCR引物的設(shè)計)、構(gòu)建載體的酶切、瓊脂糖凝膠電泳及測序鑒定、PCR引物的合成、RT-PCR擴(kuò)增、間接免疫熒光檢測、MTT實驗、