SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究.pdf

1、SOX(SRY-like HMG box)基因家族編碼了一類具有高度保守HMG(highmobility group)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，該家族成員通過識別特定的DNA序列結(jié)合到基因組上并對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在真核生物的胚胎發(fā)育等生物過程中發(fā)揮了重要的作用。目前在人類和老鼠的基因組中共發(fā)現(xiàn)了20個SOX家族成員。SOX4是SOX家族中C亞族的成員之一，該亞族還包括SOX11和SOX12。
　　SOX4已被證實對B細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和成骨

2、細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用并參與調(diào)控了神經(jīng)細(xì)胞的分化。大量研究報道SOX4在多種腫瘤組織例如腺樣囊性癌、肝腫瘤、膀胱癌、急性粒細(xì)胞白血病、前列腺癌、內(nèi)皮細(xì)胞癌和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)。
　　在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期SOX4與SOX11對細(xì)胞的發(fā)育、成熟起著至關(guān)重要的作用。在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中，SOX4受到TGF-beta的調(diào)控，誘導(dǎo)干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2的表達(dá)，對維持其腫瘤干細(xì)胞的特性起到了重要的作用。本實驗室成員已對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織進(jìn)行定量PCR

3、和免疫組化分析并證實，SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)均高于正常腦組織。然而SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的作用及其分子機理目前尚無報道。本人針對SOX4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的功能和其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了研究，共分為四個部分:
　　首先，我用Real-time PCR方法驗證了SOX4基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，為了研究SOX4對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞功能的影響，我利用RNA干擾技術(shù)抑制SOX4表達(dá)并發(fā)現(xiàn)SOX4表達(dá)降低的膠質(zhì)瘤

4、干細(xì)胞的增殖變快，細(xì)胞連接減弱，細(xì)胞出現(xiàn)分化的趨勢，提示SOX4可能具有抑制癌細(xì)胞生長的功能。
　　第二部分，我選取膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中SOX4表達(dá)量相對較低的細(xì)胞系，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和慢病毒感染的方法分別在細(xì)胞中瞬時或穩(wěn)定高表達(dá)外源SOX4基因并觀察SOX4對這些細(xì)胞生物行為學(xué)的影響。細(xì)胞功能實驗發(fā)現(xiàn)在SOX4基因瞬時及穩(wěn)定過表達(dá)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖、克隆形成能力均明顯減弱，且細(xì)胞發(fā)生G0/G1細(xì)胞周期阻滯。為了驗證SO

5、X4過表達(dá)對細(xì)胞功能造成以上影響，接下來我利用Cre重組酶將外源的SOX4片段從穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞中敲除，發(fā)現(xiàn)外源SOX4被敲除的細(xì)胞的增殖等功能得到了相應(yīng)的恢復(fù)，G0/G1細(xì)胞周期阻滯減少。通過對p53-p21信號通路的研究發(fā)現(xiàn)SOX4在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)的同時增加了細(xì)胞核內(nèi)p53蛋白的含量，上調(diào)了其下游信號p21蛋白的表達(dá)，促使細(xì)胞進(jìn)入G0/G1細(xì)胞周期阻滯。
　　第三部分，我利用基因芯片技術(shù)分析了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤LN229細(xì)胞中SOX

6、4基因高表達(dá)所造成的基因表達(dá)譜的改變。用穩(wěn)定高表達(dá)SOX4的LN229細(xì)胞和對照組LN229細(xì)胞做基因表達(dá)芯片進(jìn)行比較后，我找到了633個基因受到SOX4調(diào)控后表達(dá)差異大于1.8倍。對這些基因進(jìn)行功能聚類分析發(fā)現(xiàn)，SOX4調(diào)控了包括細(xì)胞周期(cell cycle)、發(fā)育（growth）、染色體相關(guān)(chromosome)、DNA復(fù)制、包裝(DNA replication、packaging)、月旨質(zhì)代謝(steroid metaboli

7、c)等生物學(xué)過程。其中，我發(fā)現(xiàn)beta-catenin的mRNA水平隨著SOX4的高表達(dá)而上調(diào)，并且該變化在蛋白水平也得到了驗證。通過細(xì)胞核/細(xì)胞漿蛋白的Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，雖然beta-catenin在細(xì)胞總蛋白中的含量上升，但是細(xì)胞核內(nèi)的beta-catenin并沒有增加，這說明beta-catenin受到SOX4調(diào)控高表達(dá)后未能定位到細(xì)胞核，因此不能與TCF/LEF形成復(fù)合物轉(zhuǎn)錄激活Wnt通路的下游信號，故SOX4高

8、表達(dá)的beta-catenin未能發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。
　　最后，我利用免疫共沉淀與高通量測序結(jié)合技術(shù)(ChIP-seq)對LN229細(xì)胞中SOX4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因進(jìn)行了研究。我找到了437個受到SOX4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因，與基因芯片的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，其中有18個基因表達(dá)受到SOX4的調(diào)控而改變（變化＞1.5倍），其中9個基因的表達(dá)差異大于1.8倍。同時有44個基因在前列腺癌中也被發(fā)現(xiàn)是SOX4的靶基因，我通過PCR驗證和wes

9、tern blot實驗證明了HDAC9受到SOX4的直接調(diào)控。
　　總之，本文證明了SOX4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中高表達(dá)，并且用RNAi將SOX4低表達(dá)后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長加快，且細(xì)胞連接緊密程度降低，一些干細(xì)胞marker（如CD44）基因表達(dá)降低，細(xì)胞出現(xiàn)分化的趨勢。第二，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中雖然SOX4能夠上調(diào)beta-catenin的表達(dá)，但是beta-catenin未能定位到細(xì)胞核內(nèi)，不能激活Wnt下游信號，從而不