活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管生長中的評(píng)估作用.pdf

1、第一部分穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株建立及生物學(xué)特性評(píng)價(jià)
　　目的：
　　體外分離培養(yǎng)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)后，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞株GBM-EGFP，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法：
　　通過慢病毒載體將攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green flurescent protein EGFP）慢病毒轉(zhuǎn)染原代GBM細(xì)胞株，并進(jìn)行篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)，構(gòu)建出穩(wěn)定表

2、達(dá)EGFP的單細(xì)胞克隆株：GBM-EGFP。體外經(jīng)10次傳代后流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞株熒光表達(dá)的穩(wěn)定性；對(duì)GBM及GBM-EGFP兩種細(xì)胞株在生長周期，細(xì)胞生長曲線，侵襲性，VEGF的表達(dá)及裸鼠皮下成瘤方面進(jìn)行觀察，觀察經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后構(gòu)建的細(xì)胞株GBM-EGFP較原代細(xì)胞的生物學(xué)特性是否發(fā)生改變。
　　結(jié)果：
　　通過慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，通過篩選及單克隆建立GBM-EGFP細(xì)胞株，能夠在體外穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白。經(jīng)

3、過30天體外培養(yǎng)后，能高效穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，流式分析檢測(cè)表達(dá)率為84％；細(xì)胞形態(tài)較原代細(xì)胞未發(fā)生改變。GBM-EGFP細(xì)胞株生長曲線、細(xì)胞周期、侵襲能力與未轉(zhuǎn)染的原代GBM一致。將GBM-EGFP細(xì)胞注入BALB/c-nu小鼠皮下，分別建立GBM及GBM-EGFP裸鼠皮下模型，顯示兩者在成瘤率、腫瘤生長趨勢(shì)方面及腫瘤組織形態(tài)學(xué)上無差異。
　　結(jié)論：
　　通過慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法建立起來的GBM-EGFP細(xì)胞株能穩(wěn)定高效表

4、達(dá)綠色熒光蛋白，細(xì)胞生物學(xué)特性與母系GBM基本一致，為研究膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)良好的工具。
　　第二部分活體成像系統(tǒng)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管生長中的評(píng)估作用
　　目的：
　　通過活體成像系統(tǒng)建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤皮下腫瘤模型，動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長及血管生成，分析兩者之間的關(guān)系，從而為研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，評(píng)估靶向治療提供有效的動(dòng)物模型。
　　方法：
　　建立小鼠皮下腫瘤模型：取25只裸鼠

5、隨機(jī)分成5組，于4周齡大小時(shí)皮下注射1x106個(gè)GBM-EGFP細(xì)胞。另取9只作為對(duì)照組，注射1 x106個(gè)GBM細(xì)胞，分別于1w，1.5 w，2w，2.5w，3 w，3.5w，4 w，4.5w，5 w時(shí)以活體成像系統(tǒng)觀察小鼠腫瘤熒光表達(dá)情況，測(cè)定熒光值（以光子數(shù)表示）。并于活體成像后取實(shí)驗(yàn)組及參照組裸鼠各一只取腫瘤組織行H&E染色及人CD34免疫組化(IH)觀察腫瘤血管發(fā)生及形態(tài)，統(tǒng)計(jì)微血管密度（MVD），同時(shí)行CD34免疫熒光(IF

6、)觀察腫瘤來源內(nèi)皮細(xì)胞。體外取不同細(xì)胞濃度的細(xì)胞送活體成像系統(tǒng)，分析不同濃度細(xì)胞與熒光值之間的關(guān)系，用以計(jì)算腫瘤不同時(shí)間段腫瘤內(nèi)細(xì)胞數(shù)，從而分析腫瘤生長與血管發(fā)生及血管形態(tài)之間的關(guān)系，最后以流式加以驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　體外實(shí)驗(yàn)顯示GBM-EGFP熒光表達(dá)穩(wěn)定，且熒光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)呈直線正相關(guān)。小鼠活體成像系統(tǒng)顯示接種后1w后腫瘤可在活體成像系統(tǒng)中觀察到熒光，熒光表達(dá)隨腫瘤生長逐漸增強(qiáng)。H&E染色及免疫組化顯示腫瘤接種后3d

7、開始出現(xiàn)幼稚血管，1 w開始腫瘤中央開始?jí)乃溃瑝乃乐車霈F(xiàn)血管出芽結(jié)構(gòu)，MVD在3-4w時(shí)增值最快，4w達(dá)到峰值，此后進(jìn)入平臺(tái)期，流式結(jié)果分析顯示4w時(shí)CD34+陽性率為1.63%。
　　結(jié)論：通過活體成像系統(tǒng)可建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的膠質(zhì)瘤皮下腫瘤模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)膠質(zhì)瘤體外生長的長期動(dòng)態(tài)觀察，為研究膠質(zhì)瘤的體外生長提供了良好模型；同時(shí)通過免疫熒光觀察到腫瘤來源的內(nèi)皮細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)了MVD，并以流式加以驗(yàn)證，為腫瘤來源內(nèi)皮細(xì)胞分選創(chuàng)造了條