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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:在體外模擬腸缺血及缺血再灌注,探討miR-146a及TLR4-TRAF6-NF-κB通路在其中的作用情況,為腸缺血的早期診斷及缺血相關(guān)性損傷之治療提供理論基礎(chǔ)。
方法:利用大鼠腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell,IEC-6),分別以1h、2h、3h建立不同時(shí)間缺血模型(I1h、I2h、I3h),以缺血1h再灌注1h建立缺血再灌注模型(I1hR1h),再在I1h組及I1hR1h組中調(diào)控miR-
2、146a的表達(dá),利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組miR-146a、TLR4、TRAF6、RIP、XIAP的mRNA表達(dá)水平,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Western-Blot檢測(cè)HIF-1a、TLR4、TRAF6、RIP、XIAP、SCOS-3、NF-κB、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)多重比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)
3、意義。
結(jié)果:(1) HIF-1a在缺血時(shí)表達(dá)顯著增加(P<0.01),再灌注處理后其表達(dá)下調(diào),迅速趨于正常水平。(2)腸缺血患者血漿中,miR-146a的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。(3)缺血1h后miR-146a的表達(dá)顯著降低(P<0.01),以后隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢恢復(fù),但始終低于正常;I1hR1h組的miR-146a水平高于I1h組(P<0.05),但仍顯著低于正常(P<0.05)。(4)細(xì)胞在缺血1h、2h、3
4、h情況下的凋亡率會(huì)隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,但缺血2h時(shí)與缺血3h時(shí)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;I1hR1h組的凋亡率較I1h組更高(P<0.05)。(5)在TLR4、TRAF6、RIP的mRNA水平與TLR4、TRAF6、RIP、NF-κB、cleaved-Caspase-3的蛋白水平中,具有相似的變化趨勢(shì),都是在缺血及缺血再灌注中顯著升高(P<0.05),其中在缺血1h時(shí)升高得最明顯(P<0.01),以后隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)及再灌注的發(fā)生較
5、在I1h組的基礎(chǔ)上有所下降,但始終高于正常(P<0.05);XIAP的mRNA水平與SCOS-3、XIAP的蛋白水平變化中,都是在缺血1h時(shí)顯著下降(P<0.01),以后隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)或再灌注的發(fā)生略有恢復(fù),但始終低于正常(P<0.05)。(6)在正常對(duì)照組中給予miR-146a的mimic或inhibitor處理后,可顯著上調(diào)或下調(diào)miR-146a的表達(dá)(P<0.01),但對(duì)細(xì)胞凋亡率無明顯改變,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)在I1h組中,
6、用miR-146a的mimic處理后,miR-146a的水平顯著升高(P<0.01);而用miR-146a的inhibitor處理過后,miR-146a下降趨勢(shì)不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(8)在I1hR1h組中,給予miR-146a的mimic或inhibitor處理后,可顯著上調(diào)或下調(diào)miR-146a的表達(dá)水平(P<0.05)。(9)在I1h組及I1hR1h組中,用miR-146a的mimic處理,顯著上調(diào)miR-146a的表達(dá)水平后,T
7、LR4、TRAF6、RIP、NF-κB、cleaved-Caspase-3的上調(diào)被抑制,而SOCS-3及XIAP的上調(diào)被促進(jìn),各自與單純I1h組、I1hR1h組比較具有明顯差異(P<0.05),細(xì)胞凋亡率下降,說明miR-146a抑制細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。(10)在I1hR1h組中,用miR-146a的inhibitor處理,下調(diào)miR-146a的表達(dá)水平后,TLR4、TRAF6、RIP、NF-κB、cleaved-Caspase-3表達(dá)
8、上調(diào),而SOCS-3及XIAP表達(dá)下調(diào),與單純I1hR1h組相比具有明顯差異(P<0.05),細(xì)胞凋亡率增加,說明抑制miR-146a過后加劇細(xì)胞凋亡起損傷作用。
結(jié)論:(1) miR-146a參與腸缺血及缺血再灌注過程,血漿miR-146a可望成為臨床早期診斷小腸缺血的生物學(xué)標(biāo)志;(2)TLR4-TRAF6-NF-κB信號(hào)通路參與腸缺血及缺血再灌注過程,介導(dǎo)細(xì)胞損傷;(3) miR-146a通過負(fù)調(diào)控TLR4-TRAF6-N
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