緊密連接蛋白在噪聲性聽力損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、第一部分：噪聲暴露對(duì)血迷路屏障通透性及其緊密連接蛋白的表達(dá)變化的影響
　　目的：通過建立噪聲性聽力損傷動(dòng)物模型，觀察噪聲暴露對(duì)血迷路屏障通透性及其緊密連接蛋白表達(dá)變化的影響。
　　方法：60只健康的成年雄性白化豚鼠完全隨機(jī)分為三組，即：正常對(duì)照組（20只）、噪聲暴露4h組（20只）和噪聲暴露2d組（20只）。其中噪聲暴露2d組和噪聲暴露4h組分別給予聲強(qiáng)為115dBSPL的白噪聲，每天6小時(shí)連續(xù)兩天和4小時(shí)一次；正常對(duì)照組給

2、予假噪聲暴露，即：除了不給予噪聲外，其他與噪聲暴露組無異。暴露前、后分別用聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR）檢測各組豚鼠聽閾變化，在功能上觀察噪聲對(duì)豚鼠聽力的影響。各組暴露后ABR檢測完畢，隨每組各取一只行基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽-異硫氰酸熒光素(Phalloidin-FITC)染色，在結(jié)構(gòu)上進(jìn)一步證實(shí)噪聲對(duì)豚鼠聽力的影響。另外，用常規(guī)透射電鏡和硝酸鑭透射電鏡觀察正常對(duì)照組和噪聲暴露2d組的兩組血迷

3、路屏障通透性和其緊密連接的變化；免疫組織化學(xué)染色和Western blot，檢測該兩組血管紋和螺旋韌帶處緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-5的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：ABR結(jié)果示：噪聲暴露前后，噪聲4h組和噪聲2d組其聽閾均分別有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P<0.05;**P<0.05);而噪聲暴露后，正常對(duì)照組和噪聲2d組的聽閾差異也具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(***P<0.05)。.基底膜鋪片毛細(xì)胞鬼筆環(huán)肽FITC染色顯示：噪聲暴露

4、2d組各轉(zhuǎn)基底膜外毛細(xì)胞細(xì)胞均有不同程度的損失，其中底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞大量缺失，部分毛細(xì)胞纖毛排列紊亂并出現(xiàn)倒伏和融合，而正常對(duì)照組毛細(xì)胞排列整齊，其纖毛呈V或W型，外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)（外毛細(xì)胞密度）兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；透射電鏡下，可見噪聲暴露2d組血管內(nèi)皮細(xì)胞間和邊緣細(xì)胞間的緊密連接均遭到破壞，細(xì)胞間隙增大；鑭顆粒透射電鏡下，噪聲暴露組大量鑭顆粒從血管腔內(nèi)滲漏到管腔外的組織間隙，而正常組鑭顆粒僅局限于血管腔內(nèi)；Western bl

5、ot結(jié)果示，耳蝸外側(cè)壁血管紋三組緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-5均有表達(dá)，且噪聲組的表達(dá)量明顯低于正常組；免疫組織化學(xué)染色也表明，噪聲暴露2d組和正常對(duì)照組豚鼠耳蝸外側(cè)壁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、邊緣細(xì)胞等處均有陽性顆粒表達(dá)，且噪聲2d組與正常組表達(dá)量差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05;*P<0.05）。
　　結(jié)論：噪聲通過下調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-5的表達(dá)，破壞了緊密連接，增加了豚鼠血迷路屏障的

6、通透性，從而導(dǎo)致內(nèi)耳微環(huán)境的破壞，是噪聲性聽力損傷可能的發(fā)病機(jī)制之一。
　　第二部分：噪聲暴露對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制
　　目的：進(jìn)一步探究噪聲暴露對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制，以期為臨床噪聲性耳聾的防治開辟新的治療手段和提供新的理論依據(jù)。
　　方法：90只健康的成年雄性白化豚鼠完全隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組（15只）、噪聲暴露4h組（15只）、噪聲暴露2d組（15只）、MEK抑制劑+噪聲暴露2d組（

7、15只）、VEGF受體2抑制劑+噪聲暴露2d組（15只）和DMSO+噪聲暴露2d組（15只）。其中噪聲暴露2d組、MEK抑制劑+噪聲暴露2d組、VEGF受體2抑制劑+噪聲暴露2d組和DMSO+噪聲暴露2d組給予白噪聲，其聲強(qiáng)為115dBSPL，每天6小時(shí)，連續(xù)兩天；噪聲暴露4h組給予聲強(qiáng)為115dBSPL白噪聲，4小時(shí)；MEK抑制劑+噪聲暴露2d組、VEGF受體2抑制劑+噪聲暴露2d組和DMSO+噪聲暴露2d組于每次噪聲暴露前半小時(shí)分別

8、給予腹腔注射MEK抑制劑（0.3mg/Kg）、VEGF受體2抑制劑（50mg/Kg）和DMSO（50ml/Kg）；正常對(duì)照組給予假噪聲暴露，即：除了不給予噪聲和干預(yù)外，其他與噪聲暴露組無異。暴露前、后分別用聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response,ABR）檢測各組豚鼠聽閾變化，在功能上觀察各種干預(yù)對(duì)豚鼠聽力的影響。爾后各組均取耳蝸外側(cè)壁組織用Westernblot半定量檢測緊密連接蛋白o(hù)ccludin，cla

9、udin-5，erk和P-erk的表達(dá)變化。另外，從形態(tài)學(xué)上采用免疫熒光激光共聚焦的方法觀察各組的VEGF和P-erk在血管紋處的表達(dá)分布情況。
　　結(jié)果：ABR結(jié)果示：噪聲暴露后，PD+NE2d組聽閾分別與噪聲2d組和DMSO+NE2d的聽閾差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05;***P<0.05)；而SU+NE2d組聽閾分別與噪聲2d組和DMSO+NE2d的聽閾差別也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P<0.05；****P<0.05)。提示

10、VEGF受體2抑制劑和ERK抑制劑的干預(yù)對(duì)噪聲性聽力損傷均有一定程度的保護(hù)作用。Western blot結(jié)果顯示：正常對(duì)照組、噪聲暴露4h組和噪聲暴露2d組的claudin-5和occludin表達(dá)逐步下降；而正常對(duì)照組、噪聲暴露4h組和噪聲暴露2d組的P-erk的表達(dá)逐步增高（T-erk表達(dá)量不變），提示噪聲暴露下調(diào)了耳蝸外側(cè)壁緊密連接蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了ERK的磷酸化水平，并呈現(xiàn)一定量效趨勢；當(dāng)于噪聲暴露前給予MEK抑制劑PD98

11、059后，緊密連接蛋白的表達(dá)水平高于單純?cè)肼暠┞?d組和DMSO+噪聲暴露2d組，當(dāng)噪聲暴露前給予VEGF受體2抑制劑SU1498后，緊密連接蛋白的表達(dá)水平也明顯高于單純?cè)肼暠┞督M和DMSO+噪聲組，提示VEGF和磷酸化ERK共同參與了噪聲對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)的下調(diào)。免疫熒光激光共聚焦結(jié)果示：于血管紋處，噪聲暴露2d組的磷酸化Erk表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，且磷酸化ERK的綠色熒光與胞核紅色熒光有共染現(xiàn)象，再次提示噪聲上調(diào)了ERK的磷酸化水

12、平且磷酸化的ERK發(fā)生了核轉(zhuǎn)位；VEGF受體2抑制劑+噪聲暴露2d組和MEK抑制劑+噪聲暴露2d組的磷酸化ERK表達(dá)較噪聲暴露2d組明顯下降，再次提示噪聲通過VEGF激活了ERK通路。于邊緣細(xì)胞處，單純?cè)肼暠┞?d組和DMSO+噪聲暴露2d組的VEGF表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，提示噪聲暴露上調(diào)了邊緣細(xì)胞處VEGF的表達(dá)。
　　結(jié)論：噪聲暴露可能通過上調(diào)邊緣細(xì)胞的VEGF表達(dá)，激活了內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和邊緣細(xì)胞在內(nèi)的ERK通路，從而最終