AMPK信號(hào)通路在熱誘導(dǎo)豬睪丸支持細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)中的作用.pdf

1、熱應(yīng)激（heat stress，HS）指動(dòng)物對(duì)熱環(huán)境的舒適區(qū)上限溫度所產(chǎn)生的一系列生理反應(yīng)。隨著溫室效應(yīng)的加劇，夏季持續(xù)高溫引起的熱應(yīng)激嚴(yán)重影響了家畜的繁殖性能，對(duì)畜牧業(yè)造成的損失越來越嚴(yán)重。因此研究熱應(yīng)激對(duì)家畜繁殖性能的影響對(duì)于減少夏季熱應(yīng)激對(duì)動(dòng)物的不良影響，提高經(jīng)濟(jì)效益具有十分重要的意義。豬皮下脂肪較厚，汗腺不發(fā)達(dá)，其體內(nèi)熱量較難通過皮膚蒸發(fā)，因此豬很不耐熱。公豬對(duì)環(huán)境溫度尤其敏感，高溫環(huán)境可對(duì)公豬的生殖性能產(chǎn)生明顯影響，引起精液量

2、減少、精子活力降低、精子畸形率升高。盡管冷凍精液技術(shù)已有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，但豬冷凍精液由于繁殖成績(jī)不理想未得到大面積應(yīng)用，因此夏季熱應(yīng)激引起公豬生精能力降低對(duì)整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生的影響較難通過使用冷凍精液而改善。全面、深入地研究熱應(yīng)激對(duì)公豬精子發(fā)生過程的影響，可為預(yù)防和緩解熱應(yīng)激對(duì)公豬繁殖性能的影響提供重要的理論依據(jù)。
　　支持細(xì)胞間的緊密連接是構(gòu)成血睪屏障的重要結(jié)構(gòu)，在精子發(fā)生過程中起了關(guān)鍵性的作用。它將生精上皮分為基底室和近腔室。細(xì)線前

3、期精母細(xì)胞必須穿過緊密連接結(jié)構(gòu)進(jìn)入近腔室才能完成減數(shù)分裂過程進(jìn)而分化為成熟的精子。此外，其屏障作用為精子發(fā)生提供了穩(wěn)定的微環(huán)境。熱應(yīng)激可引起緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)及表達(dá)異位，從而破壞緊密連接結(jié)構(gòu)。目前關(guān)于熱應(yīng)激對(duì)緊密連接影響的報(bào)道多為在體實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)也多聚焦于成熟的體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞，但未成熟的支持細(xì)胞內(nèi)緊密連接相關(guān)蛋白是否表達(dá)、表達(dá)部位如何以及熱應(yīng)激對(duì)未成熟支持細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白的作用均未見報(bào)道。盡管熱應(yīng)激可通過改變成熟支持細(xì)胞內(nèi)

4、緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響精子發(fā)生，但由于支持細(xì)胞間緊密連接是逐步形成的，熱應(yīng)激對(duì)未成熟的支持細(xì)胞內(nèi)緊密連接相關(guān)蛋白的影響也可能影響成熟后血睪屏障的形成。鑒于此，本文以仔豬睪丸支持細(xì)胞為研究對(duì)象，探究熱應(yīng)激對(duì)未成熟的支持細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白表達(dá)的影響，并解析其中的分子機(jī)制。
　　AMPK是真核細(xì)胞內(nèi)能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，同時(shí)也參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間緊密連接的功能：AMPK的激活可促進(jìn)緊密連接形成，敲除AMPK則可導(dǎo)致緊密連接功能喪

5、失，但AMPK對(duì)睪丸內(nèi)緊密連接的調(diào)控作用未見報(bào)道。另外，熱應(yīng)激常引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，使細(xì)胞遭受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)ROS可通過調(diào)節(jié)AMPK上游調(diào)控分子CaMKKβ的表達(dá)量進(jìn)而調(diào)節(jié)AMPK的活性。基于以上研究背景，本研究提出假設(shè)：熱應(yīng)激使支持細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而通過抑制AMPK信號(hào)通路調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)。本文所得研究結(jié)果如下：
　　1.支持細(xì)胞體外HS模型的建立及HS對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　首先比

6、較兩種熱處理方法（43℃水浴30 min與43℃氣浴30 min）對(duì)支持細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)氣浴法可引起支持細(xì)胞活力發(fā)生可逆性下降（降低34.46％， P<0.01），而隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其活力在48 h可恢復(fù)至正常；水浴法亦可引起細(xì)胞活力降低（降低57.94%，P<0.01），但至熱處理后第48 h，活力進(jìn)一步降低為對(duì)照組的29.49%，因此選擇43℃氣浴30 min作為支持細(xì)胞體外熱處理模型。利用此模型發(fā)現(xiàn)，熱處理可通過降低線粒體

7、膜電位顯著增加支持細(xì)胞早期凋亡率（增加367.87%，P<0.01），撤除熱處理后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，支持細(xì)胞早期凋亡率逐漸降低并恢復(fù)至正常。
　　利用 western blotting及熒光定量 PCR對(duì)緊密連接相關(guān)蛋白（Claudin-11、JAM-A、Occludin、ZO-1）及mRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四種蛋白均能在體外培養(yǎng)的未成熟的公豬支持細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；熱處理后緊密連接相關(guān)蛋白的mRNA及蛋白水平顯著下調(diào)；撤除熱處理后隨著時(shí)間

8、的延長(zhǎng)，緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量逐漸恢復(fù)。通過免疫熒光技術(shù)對(duì) Claudin-11在支持細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)盡管體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞間未形成緊密連接結(jié)構(gòu)，但 Claudin-11大量表達(dá)于支持細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)及囊泡膜上，且表達(dá)呈彌散型。熱處理后 Claudin-11僅少量表達(dá)于囊泡膜上，撤除熱處理后48 h，Claudin-11在支持細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可得到恢復(fù)。以上結(jié)果表明：熱處理可引起支持細(xì)胞內(nèi)緊密連接相關(guān)蛋白的mRNA及蛋白水平發(fā)生

9、可逆性下調(diào)，并使Claudin-11的表達(dá)部位發(fā)生變化。
　　2.AMPK信號(hào)通路在HS影響緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)中的作用
　　本研究首先發(fā)現(xiàn)熱處理可抑制AMPK活性，使AMPK磷酸化水平降低60.04%（P<0.01），而這一變化可隨恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸恢復(fù)。隨后對(duì)AMPK上游調(diào)控因子（ATP、CaMKKβ、LKB1）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)熱處理后支持細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低為對(duì)照組的48.92%（P<0.01），CaMKKβ表達(dá)量下調(diào)為對(duì)

10、照組的46.18%（P<0.01），而LKB1活性未見變化。利用CaMKKβ的特異性抑制劑STO609（10μmol/L，2 h）對(duì)CaMKKβ進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)可在熱處理后進(jìn)一步抑制AMPK活性，相比于單獨(dú)熱處理組下降62.19%（P<0.01），而STO609單獨(dú)作用卻對(duì)AMPK活性無明顯影響，說明熱處理通過抑制CaMKKβ的表達(dá)進(jìn)而抑制AMPK的活性。
　　為了進(jìn)一步探究 AMPK在熱處理下調(diào)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)中是否發(fā)揮作用，

11、本研究利用AMPK特異性激活劑AICAR（2 mmol/L，2 h）處理支持細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先激活A(yù)MPK再進(jìn)行熱處理，緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量的下降幅度明顯減?。浑S后利用過表達(dá)載體pcDNA-AMPK/siRNA對(duì)AMPK進(jìn)行過表達(dá)/干涉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá) AMPK可部分挽救熱處理引起的緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)。免疫熒光結(jié)果表明，熱處理后Claudin-11在支持細(xì)胞中的定位也在AMPK被激活或過表達(dá)后發(fā)生變化，從僅表達(dá)于囊泡膜表面變?yōu)閺?/p>

12、散于胞質(zhì)、胞膜及囊泡膜表面。而干涉 AMPK后再行熱處理，緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)量較單獨(dú)熱處理組進(jìn)一步下調(diào)，且Claudin-11在支持細(xì)胞內(nèi)幾乎檢測(cè)不到。這說明CaMKKβ介導(dǎo)的AMPK在熱處理調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)中起了關(guān)鍵作用。
　　3.氧化應(yīng)激在HS調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)中的作用
　　熱處理后支持細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平顯著上調(diào)，而抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性在熱處理后顯著降低。隨著熱處理后恢復(fù)時(shí)間的延

13、長(zhǎng)，以上指標(biāo)均逐漸恢復(fù)至正常水平。這表明熱處理可使支持細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。
　　通過提前添加抗氧化劑 NAC（N-acetyl-L-cysteine，N-乙酰半胱氨酸），發(fā)現(xiàn)NAC（1 mmol/L，2 h）通過降低熱處理后支持細(xì)胞內(nèi)ROS及MDA水平，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT的活性，從而減輕熱處理后支持細(xì)胞的氧化損傷。同時(shí)，NAC的添加亦可降低支持細(xì)胞在熱處理后的早期凋亡率，進(jìn)而提高熱處理后支持細(xì)胞的活性。本

14、研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) NAC可上調(diào)熱處理后支持細(xì)胞內(nèi) CaMKKβ表達(dá)量，并提高AMPK的活性，結(jié)果說明熱處理通過ROS的產(chǎn)生抑制CaMKKβ的表達(dá)，進(jìn)而抑制 AMPK活性。最后本研究還發(fā)現(xiàn) NAC的添加可有效緩解熱處理引起的緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)和Claudin-11在細(xì)胞內(nèi)異位。
　　綜上所述，熱處理通過提高支持細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，抑制CaMKKβ的表達(dá)，進(jìn)而抑制AMPK活性，從而引起緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)和在細(xì)胞中的定位發(fā)生可逆性