肝動(dòng)脈斷流對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其機(jī)理和干預(yù)研究.pdf

1、“去血供療法”是臨床上針對(duì)不可切除肝癌常用的治療手段，主要包括肝動(dòng)脈結(jié)扎(Hepatic artery ligation，HAL)，經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞(Transarterial embolization，TAE)和經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞(Transarterial chemoembolization，TACE)等[1，2]。其中TACE是目前中晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段[3]。另外，近年成為終末期肝癌標(biāo)準(zhǔn)療法的抗血管生成治療(如Sorafinib和S

2、unitinib等)在一定程度上也屬于“藥物性去血供”的范疇[3，4]。值得注意的是，雖然“去血供治療”療效被多數(shù)臨床隨機(jī)對(duì)照研究或薈萃分析證實(shí)，但其也存在以下不確定性：①治療不徹底，殘留少數(shù)腫瘤細(xì)胞，成為日后肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的來(lái)源[1]。②療效短暫，僅能延緩而不是阻斷肝癌發(fā)展，病人中位生存期最多延長(zhǎng)至16個(gè)月[2，3]。③少數(shù)臨床觀察發(fā)現(xiàn)治療本身促進(jìn)殘癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，甚至導(dǎo)致病人生存期縮短[5-9]。④多中心臨床隨機(jī)對(duì)照分析提示術(shù)前

3、。TAE/TACE不能延長(zhǎng)可切除肝癌病人的生存期[10-12]，可能與“去血供”后腫瘤肺轉(zhuǎn)移增加有關(guān)[9]。
　　基于上述發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)擬研究“去血供治療”對(duì)殘余肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的影響，分析其分子機(jī)制及可干預(yù)靶點(diǎn)，為進(jìn)一步提高“去血供”療效提供理論依據(jù)。
　　1，建立能模擬臨床“去血供治療”的人肝癌裸鼠原位移植并HAL模型(中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009，26:115-117)
　　由于獲取“去血供治療”后臨床肝癌樣本較為

4、困難，開(kāi)展“去血供”后殘余肝癌生物學(xué)特性的研究多通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)完成，主要選用動(dòng)物源性腫瘤，不具有人源性背景[13-15]；且一般采用經(jīng)血管直接注入癌細(xì)胞的“實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移模式(Experimental metastatis)”[16]，不能完整反映肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的全過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)用較高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞(MHCC97)及較低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2或Hep3B細(xì)胞行裸鼠原位種植，繼以HAL模擬臨床“去血供”，為開(kāi)展相關(guān)研究提供了合適的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)平

5、臺(tái)。
　　該動(dòng)物模型特征如下：人肝癌裸鼠原位種植成瘤率幾近100％(56/56)；較高轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97(或帶紅色熒光標(biāo)記的MHCC97-R)移植瘤自發(fā)肺轉(zhuǎn)移率達(dá)40％以上[17]；而低轉(zhuǎn)移潛能的HepG2(或帶紅色熒光標(biāo)記的HepG2-R)或Hep3B(或帶紅色熒光標(biāo)記的Hep3B-R)移植瘤腹腔轉(zhuǎn)移率也超過(guò)50％。通過(guò)分析肝臟移植瘤生長(zhǎng)曲線、瘤內(nèi)血供(彩色多普勒超聲)及側(cè)枝循環(huán)建立時(shí)間，選定原位接種肝癌術(shù)后2周為HAL手術(shù)

6、時(shí)機(jī)。HAL手術(shù)成功率達(dá)到93.3％(28/30)。HAL后，移植瘤內(nèi)缺氧細(xì)胞(Pimonidazole陽(yáng)性染色)及組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)蛋白水平顯著增加(P<0.05)[18]，證實(shí)“去血供”有效。
　　考慮到“去血供治療”主要的生物學(xué)效應(yīng)是誘發(fā)或加重瘤內(nèi)缺氧[19，20]，為進(jìn)一步分析缺氧對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究用氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞缺氧

7、建立了體外模型。通過(guò)分析其量效性，選定100μmol/L作為COCl2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞缺氧的有效濃度；同時(shí)對(duì)比其時(shí)效性，發(fā)現(xiàn)處理肝癌細(xì)胞12h后，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)即增加，48h～72h達(dá)到高峰。因此以48h～72h作為體外實(shí)驗(yàn)的有效時(shí)間段。
　　2，“去血供治療”抑制肝癌原發(fā)瘤生長(zhǎng)，但促進(jìn)殘癌的侵襲、轉(zhuǎn)移(Cancer Science，2010，101:120-128)
　　利用上述HAL模型，本研究觀察“去血供治療”

8、對(duì)肝癌原發(fā)瘤生長(zhǎng)和殘癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的影響。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(1)HAL后腫瘤組織壞死增加，殘癌細(xì)胞增殖抑制，原發(fā)瘤體積縮小―MHCC97-R移植瘤體積：HAL組2.0±0.2 cm3 vs.假手術(shù)組4.0±0.6cm3(P<0.01)；HepG2-R移植瘤體積：HAL組2.8±0.2 cm3 vs.假手術(shù)組4.6±0.9mm3(P<0.05)。(2)但殘癌細(xì)胞的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯增加，表現(xiàn)為：①肝臟原發(fā)瘤組織學(xué)顯示，HA

9、L導(dǎo)致腫瘤包膜破壞、殘癌細(xì)胞局部侵襲，微血管侵犯和癌栓形成。②體視熒光顯微鏡顯示，HAL增加肝癌移植瘤肝內(nèi)、外轉(zhuǎn)移(MHCC97-R：肝內(nèi)播散+腹膜種植+肺轉(zhuǎn)移；HepG2-R：肝內(nèi)播散+腹膜種植)。③荷瘤裸鼠肺組織連續(xù)切片發(fā)現(xiàn)，MHCC97-R肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移率和轉(zhuǎn)移灶數(shù)量也在HAL后顯著增加(HAL組83.3％[10/12]與66.1±15.6個(gè)/只vs.假手術(shù)組33.3％[4/12]與49.3±6.8個(gè)/只，P<0.05)。(3)生

10、存分析發(fā)現(xiàn)，HAL不能延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間--MHCC97-R：HAL組56.0±4.6天vs.假手術(shù)組60.7±5.8天(P>0.05)；HepG2-R：HAL組54.3±4.5天vs.假手術(shù)組60.7±5.8天(P>0.05)。類(lèi)似結(jié)果也見(jiàn)于體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)“去血供”促癌效應(yīng)與缺氧的相關(guān)性：100pmol/L COCl2誘導(dǎo)缺氧顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，但提高了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲潛能：(1)缺氧培養(yǎng)48h后，肝癌細(xì)胞遷移距離較常氧組增加：M

11、HCC97細(xì)胞：缺氧組472.5±87.2μm vs.常氧組346.8±65.6μm(P=0.022)；HepG2細(xì)胞：缺氧組474.9±65.41μm vs.常氧組388.3±67.7μm(P=0.041)。(2)缺氧培養(yǎng)72h后，肝癌細(xì)胞侵襲數(shù)目也較常氧組增加(個(gè)/200×視野)：MHCC97：缺氧組75.8±12.7 vs.常氧組43.3±4.9(P=0.003)；HepG2：缺氧組52.0±4.6 vs.常氧組26.7±5.5(

12、P<0.0001)。
　　結(jié)果證實(shí)，“去血供治療”雖然抑制肝癌原發(fā)瘤生長(zhǎng)，但促進(jìn)了殘癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，與缺氧的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。
　　3，“去血供治療”對(duì)肝癌移植瘤內(nèi)缺氧的影響(中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009，26:988-990)
　　缺氧是“去血供治療”的主要抗癌機(jī)制，但也有上述促癌效應(yīng)[21]。近年來(lái)缺氧增加腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移潛能及誘導(dǎo)放、化療抵抗等均被廣泛證實(shí)，并以促進(jìn)腫瘤血管新生最為重要[22-24]。然而瘤內(nèi)缺

13、氧具有波動(dòng)性，新生腫瘤血管及側(cè)枝循環(huán)反過(guò)來(lái)緩解缺氧，也減弱了其促癌效應(yīng)[22，25]。本研究對(duì)HAL后肝臟移植瘤缺氧的實(shí)效性及與血管生成的相關(guān)性做分析。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HAL短期(2天)內(nèi)增加腫瘤組織HIF-1α蛋白表達(dá)及缺氧細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)，但對(duì)遠(yuǎn)期(4周)無(wú)明顯影響(P>0.05)。術(shù)后2天，HAL組血清VEGF水平(922.5±59.3pg/mL vs.349.6±46.5 pg/mL，P<0.01)或移植瘤組織VE

14、GF表達(dá)較假手術(shù)組升高(P<0.05)，而4周時(shí)上述指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05)。HAL組移植瘤內(nèi)微血管密度(Microvessel density，MVD)在術(shù)后2天較對(duì)照組有增加趨勢(shì)，但與4周時(shí)類(lèi)似，兩組差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)果證實(shí)，HAL增加肝癌組織短期而并非遠(yuǎn)期的缺氧，可能與缺氧促進(jìn)腫瘤血管新生及側(cè)枝循環(huán)形成，重顰腫瘤血供有關(guān)。新生腫瘤血管形成是一個(gè)持久過(guò)程，上述短暫缺氧更可能激活某些早期促轉(zhuǎn)移

15、機(jī)制(如粘附性降低)提高殘癌侵襲、轉(zhuǎn)移潛能。
　　4，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是“去血供治療”后殘余肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移潛能增加的重要機(jī)制(Cancer Science，2010，101:120-128；中華肝膽外科雜志，2009，28:812-816；中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，校樣)
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的起始環(huán)節(jié)，被視為癌細(xì)胞入血前的特征性改變[26

16、-28]。發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)表型，具有更強(qiáng)的侵襲能力，從而利于其脫離原發(fā)病灶，侵入周?chē)芑蛄馨凸芟到y(tǒng)，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。缺氧促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，增加侵襲潛能的證據(jù)已有報(bào)道[29-31]，本實(shí)驗(yàn)研究“去血供”與EMT的關(guān)聯(lián)性是基于：(1)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果(中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009，26:988-990)--“去血供”通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤早期而并非長(zhǎng)期缺氧，最終增加殘癌轉(zhuǎn)移，提示短暫缺氧可能激活某些轉(zhuǎn)移早期機(jī)制如EMT，促進(jìn)轉(zhuǎn)移。(2)文

17、獻(xiàn)報(bào)道TAE/TACE能引起肝癌組織間質(zhì)化，出現(xiàn)肉瘤樣變[32]，其分子特征符合EMT變化，如上皮分子E-cadherin表達(dá)減少和間質(zhì)分子Vimentin上調(diào)等[33]。
　　結(jié)果顯示，(1)在100μmol/L COCl2誘導(dǎo)的體外缺氧環(huán)境中，PLC/PRF/5、HepG2、Hep3B和MHCC974種肝癌細(xì)胞均出現(xiàn)類(lèi)似EMT的形態(tài)學(xué)變化--由緊密聯(lián)結(jié)、鋪路石樣的生長(zhǎng)模式向分散、紡錘樣多極化的形態(tài)轉(zhuǎn)化。EMT相關(guān)分子表達(dá)也發(fā)生

18、改變：①上皮分子E-cadherin下調(diào)和間質(zhì)分子N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加；②EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist表達(dá)增加。并且上述改變與缺氧肝癌細(xì)胞增強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力有關(guān)。(2)在體內(nèi)模型上，HAL不但導(dǎo)致腫瘤組織E-cadherin表達(dá)減少，而且促其細(xì)胞內(nèi)移位；同時(shí)N-cadherin、Snail、Slug和Twist等EMT相關(guān)分子上調(diào)。該變化與HAL后殘余肝癌增加的局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。另

19、外，HAL加重瘤內(nèi)缺氧的同時(shí)還誘導(dǎo)癌旁組織缺氧，癌旁正常肝細(xì)胞上類(lèi)似的EMT分子變化也被觀察到，并通過(guò)正常肝細(xì)胞L02的體外缺氧實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。
　　結(jié)果證實(shí)，“去血供治療”及其誘導(dǎo)的缺氧通過(guò)激活肝癌細(xì)胞EMT而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。
　　5，β-Catenin在缺氧環(huán)境中的活化是肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT并侵襲、轉(zhuǎn)移潛能增加的關(guān)鍵(Clinical Cancer Research，2010，Accepted：中華普通外科雜志，2009，24:7

20、90-793；中華肝膽外科雜志，2010，校樣)
　　眾所周知，腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖是肝癌最重要的惡性表型[34]。但我們研究發(fā)現(xiàn)，肝動(dòng)脈斷流抑制殘癌細(xì)胞增殖(Cancer Science，2010，101:120-128)，似乎與“去血供”后增強(qiáng)的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移潛能相矛盾。因?yàn)閃nt/β-catenin通路是調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信號(hào)，β-catenin為其核心分子[34，35]，本實(shí)驗(yàn)擬研究β-catenin在缺氧環(huán)境中的表達(dá)與功

21、能的變化。另外，我們前期工作顯示，肝癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin下游靶分子c-Myc和cyclinD1在缺氧環(huán)境中表達(dá)減少；而Slug[36]，Twist[37]以及肝癌干細(xì)胞標(biāo)記分子EpCAM[38]等上調(diào)(Cancer Science，2010，101:120-128：中華普通外科雜志，2009，24:790-793)，提示β-catenin在缺氧促癌機(jī)制中的復(fù)雜性。
　　結(jié)果顯示，(1)β-Catenin異常表達(dá)：缺氧不改變肝

22、癌細(xì)胞β-catenin mRNA水平，但影響其蛋白表達(dá)和/或細(xì)胞內(nèi)定位：缺氧PLC/PRF/5和HepG2細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白總量增加(>2.3倍)，而缺氧MHCC97及Hep3B細(xì)胞則出現(xiàn)明顯的β-catenin胞內(nèi)積聚(>1.7倍)。上述β-catenin的穩(wěn)定表達(dá)與缺氧下調(diào)肝癌細(xì)胞內(nèi)GSK-3β，抑制β-catenin蛋白降解有關(guān)。(2)β-Catenin功能轉(zhuǎn)化：缺氧環(huán)境中異常表達(dá)的β-catenin不上調(diào)主管增殖的c

23、-Myc和cyclinD1基因，而增加侵襲相關(guān)的靶分子Slug及Twist表達(dá)，誘導(dǎo)缺氧相關(guān)EMT的發(fā)生。敲除β-catenin顯著抑制缺氧促癌效應(yīng)并逆轉(zhuǎn)缺氧細(xì)胞EMT。提示β-catenin促進(jìn)缺氧惡性潛能并發(fā)生功能轉(zhuǎn)化--從促增殖向促侵襲轉(zhuǎn)化。(3)β-catenin與HIF-1α的相關(guān)性：免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺氧肝癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin與HIF-1α形成分子復(fù)合物，但β-catenin的異常表達(dá)與HIF-1α無(wú)關(guān)。而敲除β-ca

24、tenin卻能減少HIF-1α蛋白表達(dá)，提示缺氧細(xì)胞內(nèi)HIF-1α增加受β-catenin調(diào)控。在臨床肝癌樣本上，β-catenin與HIF-1α顯著相關(guān)(P=0.034&Pearson'sχ2 test，P=0.013)，共表達(dá)β-catenin和HIF-1α的肝癌病人更易出現(xiàn)術(shù)后轉(zhuǎn)移，具有較短的總生存時(shí)間和腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間。
　　結(jié)果證實(shí)，缺氧誘導(dǎo)肝癌β-catenin激活及功能轉(zhuǎn)化，調(diào)控細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。
　

25、　6，阻斷缺氧細(xì)胞EMT和/或β-catenin活化可提高“去血供治療”療效(CancerScience，2010，101:120-128：Clinical Cancer Research，2010，Accepted：中華普通外科雜志，2010，校樣)
　　根據(jù)EMT發(fā)生和β-catenin活化與缺氧惡性表型的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)分別將EMT和β-catenin作為干預(yù)靶點(diǎn)，協(xié)同“去血供”治療裸鼠肝癌。
　　結(jié)果顯示：(1)將PI

26、3K特異性抑制劑LY294002作為阻斷細(xì)胞EMT的藥物[39]，發(fā)現(xiàn)100μg/g LY294002雖然不能進(jìn)一步縮小HAL治療后的移植瘤體積，但顯著減少了腫瘤轉(zhuǎn)移(P<0.05)，并延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存時(shí)間(70.7±5.5天vs.59.2±5.9天，P=0.006)。機(jī)制分析顯示LY294002逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)分子表達(dá)，并通過(guò)阻止GSK-3β降解而抑制β-catenin表達(dá)。(2)選定干擾素α(interferon-α

27、，IFN-α)為細(xì)胞內(nèi)β-catenin的有效抑制劑[40]，發(fā)現(xiàn)IFN-α不但減少肝癌β-catenin表達(dá)，還有效逆轉(zhuǎn)缺氧細(xì)胞內(nèi)上皮分子E-cahderin的下調(diào)及間質(zhì)分子N-cadherin增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示IFN-α劑量依賴(lài)性地增加HAL療效：中等劑量(7.5×106 U/kg)的IFN-α即顯著抑制HAL增加的腫瘤肺轉(zhuǎn)移(20％[1/5]vs.100％[5/5]，P=0.048)，延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物生存時(shí)間(68.7±5.5天57.