Fbxw7參與肝癌侵襲和轉移的機制研究.pdf

1、目的：肝細胞肝癌（HCC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其在腫瘤相關疾病中的發(fā)病率和死亡率一直居高不下。在我國，肝癌在所有腫瘤中發(fā)病率居第四位，而死亡率在腫瘤相關性死亡中居第二位。隨著醫(yī)療技術的不斷進步，盡管出現(xiàn)了日益先進的診斷技術，漸漸規(guī)范精湛的外科手術，還有逐步改善的輔助性化療，甚至肝移植技術的普及，可是肝癌患者的預后依然不容樂觀。這都是由于肝癌的隱匿性發(fā)展和不可預知的轉移，多數(shù)患者在就診時就已經(jīng)失去了手術的最佳時機，而術后復發(fā)和腫瘤

2、耐藥問題，更是導致肝癌患者死亡的決定性因素。談“肝癌”色變，仍然是當前患者和醫(yī)生的深刻感觸。醫(yī)學的飛速發(fā)展，離不開醫(yī)學科研的不斷進步，迄今為止，世界各地的學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種和肝癌生長、增殖、轉移、耐藥等相關的分子及通路機制，而科研中取得的成果，諸如分子靶向治療，干細胞治療等等也在慢慢的向臨床轉化。治愈肝癌任重而道遠，其困難源于肝癌背后的機制過于復雜，另外，90％以上腫瘤患者的死亡歸因于轉移的發(fā)生，因此，研究腫瘤轉移的機制和預防具有非常重

3、要的意義。
　　自從泛素—蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）被發(fā)現(xiàn)后，多方證實其參與了細胞的基因轉錄、周期調控、凋亡與分化、信號轉導和細胞發(fā)育等多個生物學過程，是一種重要的蛋白質翻譯后修飾體系。其中泛素連接酶E3中最核心的F-box蛋白—Fbxw7，可識別多個原癌蛋白并參與其泛素化和降解，發(fā)揮著抑制腫瘤的生物學功能，近年研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中Fbxw7發(fā)生了基因突變或表達降低。
　　Fbxw7蛋白是當前研究的熱點之一，比較集中的研究方向有

4、干細胞和腫瘤干細胞的轉歸，腫瘤增殖和侵襲，耐藥等等。但在肝癌方面的研究為數(shù)不多，集中涉及其在肝癌組織的表達情況及對肝癌細胞增殖的影響，目前國內外還未見有Fbxw7在肝癌侵襲和轉移中的機制的報導，因此，本課題設計并施行了以下研究，為探求Fbxw7在肝癌轉移中是否起到了作用及其作用機制有哪些。
　　方法：首先收集并隨訪了102例肝癌患者的組織標本，石蠟包埋并切片，利用免疫組化染色來觀察Fbxw7在肝癌和癌旁組織中的表達情況，并與患者的

5、臨床病理資料結合來分析Fbxw7對于肝癌的意義，隨后用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測了肝癌細胞系中Fbxw7的mRNA和蛋白水平的表達。接下來構建了能夠穩(wěn)定下調/上調 Fbxw7的病毒載體并轉染至肝癌細胞系，使肝癌細胞系可以穩(wěn)定下調/上調Fbxw7的表達，繼而使用Real-time PCR，Western-blot，ELISA，Transwell實驗，構建裸鼠肺轉移模型等實驗方法檢測轉染病毒后的肝癌細胞轉

6、移相關指標的改變，并探索其中涉及到的機制。
　　結果：
　　1.免疫組化染色結果得知在肝癌組織中Fbxw7的表達比癌旁組織中要低。與臨床病理特征結合的分析結果顯示，高Fbxw7水平和低Fbxw7水平組患者之間，腫瘤分化（P=0.013），脈管浸潤（P=0.031），轉移（P=0.027）和AJCC腫瘤分期（P=0.047）都是有明顯的統(tǒng)計學差異的。Kaplan-Meier法生存分析提示，高Fbxw7表達組患者有著更長的生存時

7、間（log-rank，P<0.001）。單因素和多因素Cox回歸分析均表明，低Fbxw7表達能夠作為肝癌患者預后較差的獨立指標。
　　2.以肝細胞系HL-7702為對照，使用Real-time PCR和Western-blot檢測了肝癌細胞系HepG2，SMMC7721和MHCC97H中Fbxw7的表達情況，結果提示，肝癌細胞系中 Fbxw7的表達明顯低于肝細胞系（P<0.05），且在HepG2，SMMC7721和MHCC97H中

8、Fbxw7的表達水平是依次降低的。
　　3.構建上調Fbxw7的GV341-puro慢病毒載體和下調Fbxw7的GV118-GFP慢病毒載體，根據(jù)細胞系中Fbxw7的相對高低水平選擇了在HepG2中下調Fbxw7，在MHCC97H中上調Fbxw7，轉染完畢后通過Real-time PCR和Western-blot檢測過表達和干擾效果，成功構建了KD-Fbxw7-G2和OE-Fbxw7-97H，他們各自的對照為NC-Fbxw7-G2

9、和NC-Fbxw7-97H。
　　4.在確定了病毒本身對細胞活力無影響的前提下，通過Transwell實驗及裸鼠肺轉移模型的構建實驗發(fā)現(xiàn)，下調了Fbxw7表達的 KD-Fbxw7-G2細胞的侵襲和遷移能力較對照細胞有明顯的增強，而上調了Fbxw7表達的OE-Fbxw7-97H細胞的侵襲和遷移能力比對照細胞有明顯的減弱。
　　5.通過 Western-blot，Real-time PCR及 ELISA檢測了KD-Fbxw7-G

10、2和OE-Fbxw7-97H細胞中活化的Notch1的變化情況，并檢測了ERK1/2通路的活化情況及MMP-2，MMP-9和uPA的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，抑制Fbxw7的表達可以上調Notch1的NICD的表達，并激活ERK1/2，繼而使MMP-2，MMP-9和uPA表達增加，而使用Notch1的小干擾RNA對細胞進行干擾后，本已增強的細胞遷移和侵襲的能力發(fā)生了回落。
　　結論：
　　研究結果表明，F(xiàn)bxw7可以用于肝癌患者的