Sorafenib對肝癌侵襲轉移潛能的影響及其干預—實驗研究.pdf

1、手術切除是原發(fā)性肝癌最有效的治療方法，但即使根治術后5年轉移復發(fā)率仍高達60-70％。對不能切除的肝癌和肝癌術后轉移復發(fā)的預防，抗血管生成是一條可探索的途徑，但新近的報道，抗血管生成也可促進轉移。分子靶向藥物sorafenib是目前唯一經Ⅲ期臨床試驗證實提高晚期肝癌病人生存期的藥物，但僅延長3個月生存期；在東方晚期肝癌病人的Ⅲ期臨床試驗中，sorafenib雖延長生存期，但僅推遲腫瘤進展。作為包括抗血管生成作用的sorafenib是否也

2、有促進癌轉移的作用，也是需要弄清的問題。
　　本文用不同轉移潛能的人肝癌裸鼠模型，研究sorafenib治療過程中腫瘤進展的原因，以及對腫瘤侵襲轉移潛能的影響。鑒于腫瘤轉移與腫瘤細胞及其所處微環(huán)境有關，在肝癌中也發(fā)現(xiàn)微環(huán)境中的炎癥因子、巨噬細胞可預測肝癌患者術后復發(fā)轉移。為此，本文擬從腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞兩個方面進行研究，并探索進一步提高sorafenib療效的途徑。
　　1.低劑量sorafenib誘導肝癌侵襲轉移潛

3、能增強
　　本部分工作的主要目的是在不同轉移潛能的人肝癌裸鼠模型中，探索不同劑量sorafenib對腫瘤侵襲轉移潛能的影響。首先在我所高轉移人肝癌裸鼠模型(LCI-D20)中，發(fā)現(xiàn)sorafenib低劑量(30mg/kg)和高劑量(100mg/kg)均明顯抑制腫瘤生長，并延長荷瘤鼠生存期。Sorafenib雖抑制肺轉移灶數(shù)量，但并未降低肺轉移率；而考慮到soraferu|b治療組腫瘤體積更小，以標化肺轉移率(肺轉移灶數(shù)目/腫瘤體積

4、)計算，sorafenib治療組有促進肺轉移趨勢(sorafenib低劑量組與對照組比較，P=0.069)。研究還發(fā)現(xiàn)sorafenib低劑量(30mg/kg)明顯促進肝內播散。盡管sorafenib大劑量(100mg/kg)組在用藥期間未觀察到促轉移，但治療一周后停藥，總體生存更差，在對照組小鼠全部死亡之前，大劑量組小鼠都已死亡。
　　為了進一步驗證此現(xiàn)象，我們以低劑量sorafenib(30mg/kg)在熒光標記的不同轉移潛能

5、的人肝癌裸鼠原位模型LM3-RFP(高轉移潛能，簡稱LM3)和HepG2-GFP(低轉移潛能，簡稱HepG2)中重復此試驗，發(fā)現(xiàn)低劑量somfenib(30mg/kg)明顯促進肝內播散，且不降低LM3模型腹腔轉移率和肺轉移率。通過流式細胞儀檢測外周血腫瘤細胞(circulating Rlnlor cells，CTC)，發(fā)現(xiàn)低劑量sorafenib(30mg/kg)明顯促進CTC增多。
　　2.乏氧導致上皮.間質轉化是sorafen

6、ib促侵襲轉移的重要機理
　　我們通過免疫組化染色內源性乏氧標記物乏氧誘導因子(hypoxia induciblefactor-1α，HIF-1α)和外源性乏氧標記物哌莫硝唑(Pimodazole)發(fā)現(xiàn)sorafenib治療組腫瘤組織明顯乏氧。乏氧可通過誘導上皮-間質轉化(EMT)促進侵襲轉移，因此我們在LM3和HepG2模型中，分別以免疫組化染色EMT相關指標E-cadherin、N-cadherin和Vimentin，發(fā)現(xiàn)so

7、rafenib顯著下調E-cadherin，同時上調N-eadherin和Vimentin，提示sorafenib治療后腫瘤發(fā)生上皮-間質轉化，且侵襲性增強。
　　3.Sorafenib治療下調HTATIP2等抑癌基因導致凋亡逃脫是重要分子基礎
　　我們發(fā)現(xiàn)sorafenib治療后殘余腫瘤對凋亡發(fā)生抵抗，“腫瘤信號通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片”提示6個抑癌基因HTATIP2、SERPINB5、SYK、Rb1、FAS、P53等和1個促

8、凋亡基因腫瘤壞死因子(TNF)均下調，這些下調的基因均為促凋亡基因，且多數(shù)與P53有關。逃脫凋亡是惡性腫瘤細胞的6大特征之一，誘導或促進凋亡可抑制腫瘤細胞發(fā)生轉移。為此我們推測，sorafenib治療后，抗凋亡基因SERPINB5、SYK、Rb1、FAS、HTATIP2、P53、TNF等的下調，導致腫瘤逃脫凋亡。
　　4.阿司匹林上調HTATIP2等，抑制sorafenib的促侵襲轉移作用
　　上述研究提示sorafenib

9、治療后，抑癌基因HTATIP2、SERPINB5、Rb1、FAS、P53、TNF等均下調，這些抗凋亡基因均與P53有關，且促進侵襲轉移。而aspirin具有上調P53和促凋亡作用，為此探索合用aspirin是否可通過P53作為Sorafenib的增敏劑。研究結果表明，合用aspirin后顯著抑制腫瘤生長、轉移，肝內播散灶消失，生存期延長?；蛩綑z測幾種抑癌基因，發(fā)現(xiàn)aspirin僅顯著上調HTATIP2-mRNA，但對P53-mRNA

10、無影響。蛋白水平檢測證實aspirin上調HTATIP2蛋白。
　　我們推測sorafenib誘導的肝內播散灶增多和aspirin逆轉sorafenib促肝內播散增多可能主要通過HTATIP2發(fā)揮作用。為此選擇慢病毒下調的方法，得到慢病毒穩(wěn)定轉染shHTATIP2的細胞株LM3-LV-shHTATIP2和轉染相應空載體對照細胞株LM3-LV-shNon，發(fā)現(xiàn)LM3-LV-shHTATIP2腫瘤相比LM3-LV-shNon腫瘤邊界不

11、清，提示局部侵襲性更強，LM3-LV-shHTATIP2腫瘤相比LM3-LV-shNon腫瘤，在sorafenib治療下促進肝內播散的作用較弱，而合用aspirin后對sorafenib誘導的肝內播散的抑制作用也較弱(合用aspirin+sorafenib相比單用sorafenib，在LM3-LV-shHTATIP2腫瘤降低50％的肝內播散；而在LM3-LV-shNon腫瘤中降低100％肝內播散)。另外合用aspirin+sorafen

12、ib對肺轉移的抑制作用，在LM3-LV-shHTATIP2腫瘤中也較LM3-LV-shNon腫瘤中更弱。
　　5.體外用aspirin與sorafenib合用觀察促凋亡作用
　　體外實驗以sorafenib5μM作用于LM3細胞，選擇不同時間點(0h、3h、6h、12h、24h)觀察sorafenib對HTATIP2-mRNA的作用。發(fā)現(xiàn)sorafenib5μM明顯下調HTATIP2-mRNA；選擇aspirin0.1mM/

13、0.5mM作用于細胞株LM3-LV-shHTATIP2、LM3-LV-shNon和LM3-wt，選擇不同時間點觀察，發(fā)現(xiàn)aspirin0.1 mM/0.5 mM均明顯上調HTATIP2-mRNA和HTATIP2蛋白；合用sorafenib5μM+aspirin0.1mM/0.5mM明顯逆轉sorafenib5μM對HTATIP2的抑制作用。Annexin V/PI檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，sorafenib+aspirin明顯增強sorafen

14、ib對LM3-wt和LM3-LV-shHTATIP2的促凋亡作用。因此證明Naspirin主要通過上調HTATIP2增強Sorafenib的促凋亡作用。
　　6.巨噬細胞抑制劑減少sorafenib誘導的巨噬細胞浸潤而增效
　　在血漿和腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)sorafenib治療組巨噬細胞趨化因子VEGF、SDF-1α和CSF-1明顯升高，伴隨腫瘤組織中F4/80和CD11b陽性巨噬細胞浸潤明顯增多，以及外周血中F4/80和CD11

15、b陽性細胞數(shù)目增多。合用巨噬細胞抑制劑唑來磷酸和氯磷酸鹽脂質體通過減少巨噬細胞的浸潤進一步抑制腫瘤生長，并減少肺轉移。本部分工作提示，腫瘤在sorafenib治療過程中導致腫瘤相關巨噬細胞通過分泌VEGF對抗sorafenib治療作用，可用抑制骨轉移藥物唑來磷酸增強sorafenib對肝癌的抑制作用。
　　結論
　　1.Sorafenib低劑量在不同轉移潛能人肝癌原位裸鼠模型中促進肝癌侵襲轉移潛能。
　　2.Soraf

16、enib的促侵襲轉移作用與下調抑癌基因HTATIP2有關。
　　3.Aspirin上調HTATIP2促肝癌細胞凋亡，有逆轉sorafenib的促侵襲轉移潛能作用。
　　4.巨噬細胞抑制劑唑來磷酸通過清除sorafenib誘導的巨噬細胞而增效。
　　應用價值
　　1.發(fā)現(xiàn)低劑量sorafenib促進肝癌侵襲轉移潛能增強，合用aspirin和sorafenib通過上調HTATIP2促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤侵襲轉移，

17、為提高sorafenib臨床療效提供線索。
　　2.合用巨噬細胞抑制劑唑來磷酸可提高sorafenib對肝癌的抑制作用。
　　3.為今后針對凋亡通路開發(fā)抗腫瘤藥物，或為尋找sorafenib的合用藥物提供依據(jù)。
　　創(chuàng)新點
　　1.在人肝癌原位裸鼠模型發(fā)現(xiàn)sorafenib通過下調HTATIP2促進肝癌侵襲轉移潛能。
　　2.發(fā)現(xiàn)合用aspirin通過上調HTATIP2促進凋亡和抑制腫瘤侵襲轉移，增強sor