腫瘤壞死因子-α對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響.pdf

1、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）可通過介導(dǎo)多種病理生理反應(yīng)參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病的發(fā)生發(fā)展，其中微血管內(nèi)皮細(xì)胞（microvascular endothelial cells，MVECs）是TNF-α作用的主要靶細(xì)胞之一。由于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMVECs）間形成的

2、緊密連接是構(gòu)成血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)于維持腦組織內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定具有重要作用，因此，研究TNF-α對(duì)BMVECs功能的影響，不僅有利于闡明TNF-α在腦部疾病中的作用機(jī)制，而且有利于開發(fā)針對(duì)性的預(yù)防和治療措施。
　　 目的利用原代分離培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human brain microvascularendothelial cells，HBMVECs），檢測(cè)TNF-α對(duì)HBMVECs分泌細(xì)胞因子、表達(dá)粘附分子和產(chǎn)生基質(zhì)金

3、屬蛋白酶的影響，并檢測(cè)TNF-α對(duì)HBMVECs凝血和纖溶活性的影響，以分析TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制。
　　 方法：從人腦組織分離、純化和培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞。通過細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志vWF（von Willebrand Factor）、CD31的表達(dá)，并在熒光顯微鏡下觀察其對(duì)低密度脂蛋白的攝取。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)vWF陽性細(xì)胞比例判斷內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞純度。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡檢查細(xì)胞

4、間的緊密連接。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)TNF-α刺激前后HBMVECs表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；應(yīng)用明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）活性。觀察T

5、NF-α和內(nèi)毒素（lippolysaccharide，LPS）刺激前后HBMVECs凝血纖溶活性變化：一期凝固法檢測(cè)促凝血活性（procoagulant activity，PCA）活性；ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR）檢測(cè)細(xì)胞組織因子（tissue factor，TF）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodu

6、lin，TM）、組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator，t-PA）、纖溶酶原激活物抑制物（plasminogen activator-inhibitor-1，PAI-1）的水平。
　　 結(jié)果：分離、純化的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)單層生長(zhǎng)和接觸抑制的生長(zhǎng)特性，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞典型的標(biāo)志分子vWF、CD31，并攝取乙?；兔芏戎鞍祝╝cetylated low density lipop

7、rotein，Dil-Ac-LDL）。流式細(xì)胞術(shù)分析vWF陽性細(xì)胞比例顯示細(xì)胞純度在95％以上。掃描電鏡顯示細(xì)胞間無間隙，透射電鏡檢查證實(shí)細(xì)胞間存在高電子密度的緊密連接。這種結(jié)構(gòu)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的形態(tài)特征。TNF-α對(duì)HBMVECs的功能有明顯影響：ELISA結(jié)果顯示，TNF-α劑量依賴性地上調(diào)HBMVECs表面黏附分子ICAM-1的表達(dá)，增加細(xì)胞因子IL-6的釋放；明膠酶譜分析發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激后HBMVECs產(chǎn)生的MMP-2明

8、顯增加。ELISA和Real-time PCR結(jié)果顯示，LPS和TNF-α促進(jìn)HBMVECs的凝血活性，上調(diào)PCA和TF的產(chǎn)生，抑制抗凝血活性，下調(diào)TM的表達(dá)；并明顯促進(jìn)纖溶活性因子t-PA和PAI-1的表達(dá)。通過比較PCA/TM和PAI-1/t-PA的比值發(fā)現(xiàn)，TNF-α對(duì)HBMVECs凝血活性的影響明顯強(qiáng)于LPS。
　　 結(jié)論： TNF-α可能通過影響HBMVECs的功能，導(dǎo)致腦微血管功能障礙，從而在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)