姜黃素對腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護性實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　現(xiàn)代研究表明，動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一個慢性損傷性炎癥反應(yīng)。血管內(nèi)皮細胞功能障礙是其形成的早期病變，并且參與AS發(fā)生發(fā)展的全過程。因此，預(yù)防及修復(fù)血管內(nèi)皮細胞損傷，保護其結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要意義。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的炎癥因子，它不僅對細胞具有直接毒性作用，而且通過產(chǎn)生趨化因子（chemotatic factor）

2、、誘導(dǎo)細胞粘附分子（cell adhesion molecule，CAM）表達以及誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）活化等多種途徑導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞的損傷。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chermtach protein-1，MCP-1)是單核∕巨噬細胞特異的趨化性因子，它可加速單核細胞遷移過程，使之與血管內(nèi)皮細胞粘附的單核細胞容易通過內(nèi)皮間隙遷移至內(nèi)皮下，最終導(dǎo)致AS性脂質(zhì)條紋的形

3、成。其表達增加常與NF-κB的活化相關(guān)并受其調(diào)控。NF-κB是一類參與炎癥過程中多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核轉(zhuǎn)錄因子，在AS的炎癥反應(yīng)中起重要作用。如何抑制這些致炎因子的活性，逆轉(zhuǎn)TNF對內(nèi)皮細胞的炎性損傷成為人們關(guān)注的新熱點。姜黃素是中藥姜黃的有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，尤其在保護內(nèi)皮細胞、治療心血管疾病方面具有重要意義。盡管如此，姜黃素發(fā)揮逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞損傷作用的具體機制目前尚不清楚。因此，本實驗采用TNF-α體外誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)

4、皮細胞（Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC），建立細胞損傷模型，觀察姜黃素對其保護作用，并進一步探討其可能作用機制。
　　研究目的：
　　1、原代培養(yǎng)人HUVEC，用TNF-α實施干預(yù)，模擬體內(nèi)炎癥造成的內(nèi)皮細胞損傷模型，觀察不同濃度的姜黃素作用后對內(nèi)皮細胞受到損傷的改善作用。
　　2、觀察細胞核和細胞漿中NF-κB的表達、分布情況，同時觀察姜黃素是否能夠降低其表達。

5、
　　3、檢測細胞上清液中MCP-1的表達，初步探究姜黃素保護HUVEC損傷的機制。
　　研究方法：
　　1、細胞培養(yǎng)：采用酶消化法原代培養(yǎng)HUVEC，用免疫組化法對其進行第Ⅷ因子辣根過氧化物酶染色；MTT法確定TNF-α建立細胞損傷模型的最佳濃度；同時檢測姜黃素對HUVEC活性的影響。
　　2、MTT法檢測HUVEC細胞生長抑制率。
　　3、采用免疫細胞化學(xué)法檢測正常對照組、TNF-α組和不同濃度姜黃素組

6、中NF-κB表達的情況。
　　4、用ELISA法檢測正常對照組、TNF-α組和不同濃度姜黃素組細胞上清液中MCP-1的蛋白含量，用RT-PCR法檢測MCP-1mRNA的表達水平。
　　研究結(jié)果：
　　1、原代培養(yǎng)的HUVEC細胞在48h后可見大量貼壁，最初貼壁細胞呈多角形、石塊狀或成團聚集，后逐漸伸展成長梭形，細胞體積增大，胞漿豐富，第Ⅷ因子染色呈陽性。
　　2、MTT檢測顯示，當(dāng)TNF-a濃度為10ng/L時，

7、HUVEC細胞受到的損傷最為嚴重，因此該濃度為建立細胞損傷模型的最佳濃度。
　　3、MTT法檢測HUVEC細胞生長抑制率顯示，TNF-a模型組中細胞抑制率明顯高于對照組（P<0.01）；TNF-a＋姜黃素（12.5，25，50和100μg/mL）組的細胞抑制率比TNF-a模型組明顯降低（P<0.01）且呈現(xiàn)出濃度依賴趨勢。
　　4、免疫組化染色結(jié)果顯示在正常的HUVEC胞漿中NF-κB有一定程度的表達，核內(nèi)不表達；當(dāng)加入TN

8、F-α后，NF-κB表達強度增加，表現(xiàn)為胞漿內(nèi)棕黃色染色加深，且呈現(xiàn)部分核內(nèi)表達，陽性細胞數(shù)目增多；當(dāng)加入姜黃素干預(yù)后，可以減少NF-κB的表達，低濃度時改善作用不明顯，但隨著濃度升高，抑制作用逐漸加強，陽性細胞數(shù)目隨之減少。
　　5、ELISA法檢測顯示，與對照組相比，模型組MCP-1表達明顯增加（P<0.01）；而不同濃度姜黃素作用后，與模型組相比可明顯抑制TNF-a誘導(dǎo)的MCP-1表達（P<0.01）且呈現(xiàn)出濃度依賴趨勢，但

9、與對照組相比在低濃度時表達下降不明顯。
　　6、RT-PCR法檢測HUVEC細胞在模型組和姜黃素組中β-acting基因的表達產(chǎn)物幾乎保持不變，但目的基因表達產(chǎn)物在TNF-α組中明顯增多，在姜黃素組中隨著濃度的升高逐漸減少（P<0.01）。
　　研究結(jié)論：
　　姜黃素能緩解TNF-α對HUVEC造成的炎性損傷，可能通過以下途徑：
　　1、直接減輕TNF-α對內(nèi)皮細胞的細胞毒作用；
　　2、通過抑制NF-κB