腫瘤壞死因子-α對低密度脂蛋白在血管內(nèi)皮細胞中穿胞的影響及機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是許多心、腦血管病的共同發(fā)病學基礎(chǔ)，是引起老年人死亡的最主要原因之一。近年調(diào)查表明，動脈粥樣硬化的發(fā)病率還在升高，發(fā)病的年齡有繼續(xù)年輕化的趨勢，成為威脅人類健康的一個重大問題。
　　 在病理學上，AS主要表現(xiàn)為低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL），特別是氧化修飾的低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，O

2、x-LDL）在動脈血管內(nèi)膜下的沉積，繼而引起泡沫細胞形成、炎癥反應(yīng)等一系列改變，最后導致粥樣斑塊的形成。AS發(fā)病機制雖遠未完全闡明，但血管內(nèi)皮的損傷與高脂血癥的作用最為受到關(guān)注。動脈血管內(nèi)皮細胞的損傷以及功能的改變一度被認為是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素。
　　 基于此，本論文首先研究了低密度脂蛋白以及氧化修飾的低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)無論是低密度脂蛋白，還是氧化修飾的低密度脂蛋白，在低濃度是促進內(nèi)皮細胞生長的，

3、只有在遠超出正常濃度的較高水平才能引起內(nèi)皮細胞損傷。
　　 考慮到引起內(nèi)皮細胞損傷的低密度脂蛋白以及氧化修飾的低密度脂蛋白的濃度較高，即使在高脂血癥的病人中也不常見，且許多發(fā)生動脈粥樣硬化的患者血漿脂蛋白水平并不高，本課題組設(shè)想，也許動脈粥樣硬化的發(fā)生的始動環(huán)節(jié)并不是內(nèi)皮細胞的損傷，而僅僅是內(nèi)皮細胞通透功能的增加，而這種通透不是內(nèi)皮細胞之間間隙的通透性的增加，而是內(nèi)皮細胞中穿胞（transcytosis）的增加，使得更多的脂蛋白

4、越過血管內(nèi)皮細胞，沉積于血管內(nèi)膜下，觸發(fā)AS的發(fā)生。鑒于此，本研究建立了體外脂蛋白穿胞模型，首先證實了LDL在血管內(nèi)皮細胞中穿胞的發(fā)生，且此穿胞過程與細胞膜脂筏（lipid raft，LR）及神經(jīng)酰胺(ceramide)密切相關(guān)，脂筏干擾劑（M-β-CD）及脂筏中鞘磷脂水解生成神經(jīng)酰胺的酶抑制劑（Desipramine）可有效阻止脂蛋白的穿胞。同時，考慮到炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中扮演十分重要的角色，本研究進一步研究了炎癥介質(zhì)腫瘤

5、壞死因子（TNF-α）對LDL在血管內(nèi)皮細胞中穿胞的影響，發(fā)現(xiàn)TNF-α可增加脂蛋白在血管內(nèi)皮細胞中的穿胞之后，進一步從脂蛋白受體（LDL-R）及穿胞相關(guān)蛋白caveolin-1，clathrin等表達的變化的角度對其機制進行了初步的探討，發(fā)現(xiàn)TNF-α增強脂蛋白在血管內(nèi)皮細胞中穿胞的過程，可能與其增加上述脂蛋白受體及穿胞相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。這些研究可望為開發(fā)防治動脈粥樣硬化的新藥提供全新的思路和靶點。
　　 第一部分:LDL、

6、Ox-LDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）活力的影響及甲基-β-環(huán)糊精、地昔帕明的作用
　　 目的：觀察LDL、Ox-LDL對人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力的影響以及甲基-β-環(huán)糊精、地昔帕明對其影響的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 材料和方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，利用細胞計數(shù)試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8），測定不同處理組的人臍靜脈內(nèi)皮細胞活性。
　　 結(jié)果：1、當LDL濃度＜300μg/ml時，隨著

7、LDL濃度的增加，LDL可刺激內(nèi)皮細胞增殖，當LDL濃度＞500μg /ml時，對HUVECs有明顯損傷作用；當Ox-LDL的濃度＜100μg/ml時，隨著Ox-LDL濃度的增加，Ox-LDL可刺激內(nèi)皮細胞增殖，當Ox-LDL濃度＞300μg /ml時，對HUVECs有明顯損傷作用； 2、一定濃度的M-β-CD（5mmol/L）、Desipramine（30μmol/L）可以有效的阻止或逆轉(zhuǎn)高濃度的LDL（500μg /ml）、Ox-L

8、DL（300μg /ml）對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷效應(yīng)。
　　 結(jié)論：低濃度時，LDL和Ox-LDL可以促進血管內(nèi)皮細胞生長；高濃度時，LDL和Ox-LDL會損傷血管內(nèi)皮細胞，脂筏干擾劑M-β-CD、Desipramine對這種損傷均具有逆轉(zhuǎn)作用。
　　 第二部分：LDL穿胞模型的建立以及TNF-α對LDL穿胞過程的影響及機制
　　 目的：探討TNF-α對于LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中穿胞的影響及其機制的研究。

9、r>　　 材料和方法：1、對LDL進行體外標記上熒光素FITC，成FITC-LDL；2、利用細胞培養(yǎng)小池建立穿胞模型，模仿血管內(nèi)面的內(nèi)皮細胞單層，通過測定培養(yǎng)小池外FITC熒光強度的變化來反映LDL穿胞的變化；在此模型基礎(chǔ)上，研究了脂筏干擾劑(M-β-CD、Desipramine)對LDL在內(nèi)皮中穿透過程的影響；3、利用細胞計數(shù)試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8），測定TNF-α對人臍靜脈內(nèi)皮細胞活性的影響，并

10、在建立的穿胞模型中研究了TNF-α對LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中穿胞過程的影響。4、Western blot方法檢測了人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)caveolin-1、clathrin、LDLR蛋白的表達。
　　 結(jié)果：1、在體外建立的穿胞模型中，LDL可以發(fā)生穿胞；2、脂筏干擾劑(M-β-CD、Desipramine)可以減少LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的穿胞。3、TNF-α在0.1到100ng/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對細胞活性

11、有促進的作用；而當?shù)竭_1000ng/ml的高濃度時，對細胞活性的促進作用反而減弱。用30ng/ml TNF-α處理細胞的1到4天中，隨著時間的增加，細胞的活性也會增加。4、炎癥因子TNF-α可以促進LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的穿胞。5、在TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞的一到四天中，隨著時間的延長，caveolin-1、LDLR蛋白的表達增加；而Clathrin的表達在一到三天內(nèi)會增加，第四天卻出現(xiàn)下降。在TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞的

12、30min到24h中，隨著時間的延長，caveolin-1、clathrin、LDLR的表達均有不同程度的增加。
　　 結(jié)論：1、LDL可通過內(nèi)皮細胞的穿胞作用而沉積于內(nèi)膜下。2、LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中穿胞的過程與脂筏的作用有關(guān)。3、TNF-α可以促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長，并且這種促進作用有濃度和時間依賴性；4、TNF-α可以促進LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的穿胞，并且這種促進穿胞的作用與脂蛋白受體及脂筏及相關(guān)蛋白caveo