豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白5’端基因重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性傳染病?，F(xiàn)已成為豬的一種世界性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害。在TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白是唯一能在動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。因此，S蛋白基因是研究TGEV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究的目的是利用RT-PCR技術(shù)把S基因5’端包含B、C抗原位點(diǎn)的一段序列(S1)克隆入腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中，構(gòu)建成重組腺病毒，使

2、S1蛋白在重組腺病毒中獲得表達(dá)，并在小白鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫特性研究，為研究TGEV重組腺病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的。TGEV基因序列(NC002306)設(shè)計(jì)了一對引物，針對S基因5’端包含B、C抗原位點(diǎn)的1026bp的序列(S1)，并含有BglⅡ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)。用RT-PCR技術(shù)從國內(nèi)分離的TGEVNJ株中獲得大小為1026bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后與穿梭載體pShuttle-CMV同時進(jìn)行雙酶切，

3、分別經(jīng)回收后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，然后在卡那霉素抗性(Kan<'+>)平板上挑取陽性菌落，37℃過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒經(jīng)PCR、BglⅡ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定，結(jié)果擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小相符；DNA序列分析結(jié)果表明，克隆的S1蛋白基因完全符合載體閱讀框，擴(kuò)增的S1基因與TGEVNJ株核苷酸序列符合率99％，氨基酸序列符合率99％。將鑒定正確的線性化重組質(zhì)粒pShuttle-CMV-S1與骨架載體pAdEasy-1經(jīng)電轉(zhuǎn)化在大腸桿菌菌株

4、BJ5183中進(jìn)行同源重組。在具有卡那霉素的LB平板上篩選陽性菌落，然后利用Pac I酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)計(jì)的相符，陽性重組質(zhì)粒命名為rAd-S1；鑒定的重組質(zhì)粒rAd-S1大量提取，Pac I酶酶切線性化，陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到HEK293A細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)7天后出現(xiàn)細(xì)胞病變，收獲病毒。經(jīng)噬斑純化，用RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Western blot試驗(yàn)鑒定S1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，結(jié)果表明重組腺病毒中的S1

5、蛋白基因能夠在HEK293A細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。將重組病毒在293細(xì)胞上連續(xù)傳代至9代，測定病毒滴度，其TCID<,50>平均可達(dá)10<'-7.7>／ml。 為研究TGEV S1蛋白的重組腺病毒免疫效果，將TGEV S1蛋白的重組腺病毒免疫18-20g的小白鼠。分別用皮下、肌肉、滴鼻三種接種途徑，每隔14d免疫一次，共免疫三次。檢測小白鼠血清TGEV ELISA特異性IgG和IgA抗體。結(jié)果顯示：在三個免疫組的小白鼠血清和肺勻漿中

6、能夠檢測到一定水平的IgG，且在三免后7天(即首免后35天)其OD<,450>值均能達(dá)到一個最高值，其中皮下注射免疫組的OD<,450>值高于肌肉注射免疫組和滴鼻免疫組；在三種免疫途徑的小白鼠血清和肺勻漿中均能檢測到IgA。本研究成功構(gòu)建了1株重組腺病毒，能夠穩(wěn)定表達(dá)TGEVS蛋白氨基端包含B、C兩個抗原位點(diǎn)的片段，該病毒TCID<,50>為10<'7.7>／ml。小白鼠免疫試驗(yàn)證實(shí)，該重組腺病毒具有TGEV免疫原性。本研究為以后進(jìn)一步