豬傳染性胃腸炎病毒的分子診斷與免疫研究.pdf

1、本研究從豬腹瀉病料中分離出了豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，進(jìn)行了血清學(xué)鑒定、電鏡鑒定和RT-PCR鑒定。并擴(kuò)增TGEVTS株核衣殼蛋白N基因和豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)QH株膜糖蛋白M基因，建立TGEV和PEDV的雙重RT-PCR鑒別診斷方法。另外，克隆了TGEV纖突糖蛋白S基因，將其插入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒中，獲得了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-CMV/S，對之線性

2、化后，用pAdEasyTM系統(tǒng)，電轉(zhuǎn)化已轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體pAdEasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，經(jīng)同源重組，構(gòu)建含有全S基因的重組腺病毒載體pAd/S，后者經(jīng)酶切充分暴露反向末端重復(fù)序列后，與脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，以獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-S。以RT-PCR法檢測重組腺病毒rAd-S中TGEV纖突糖蛋白S基因的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)熒光檢測外源基因的表達(dá)，用連續(xù)傳代和PCR檢測rAd-S的穩(wěn)定性

3、和安全性。為評價重組腺病毒rAd-S對豬的免疫效果，將其灌服或注射28日齡仔豬后，用阻斷ELISA檢測抗體滴度；60d后進(jìn)行TGEV強(qiáng)毒攻擊，檢驗(yàn)其保護(hù)力；將所獲得抗體與TGEV強(qiáng)毒混合后灌服3日齡乳豬，進(jìn)一步檢測重組腺病毒rAd-S免疫豬后所產(chǎn)生抗體的中和活性；以TGEV強(qiáng)毒攻擊灌服重組腺病毒rAd-S免疫母豬的乳汁的3日齡乳豬，檢測乳汁免疫對乳豬的保護(hù)力。本研究結(jié)果如下： 1)分離了一株TGEV，并通過血清學(xué)、電鏡鑒定和RT

4、-PCR鑒定，命名為TGEVTS株。 2)建立了TGEV與PEDV的特異性雙重RT-PCR鑒別診斷方法，可直接從腹瀉糞樣中檢測目的基因，為TGEV與PEDV的分子鑒別診斷提供了可行的方法。 3)克隆的TGEVTS株S基因編碼區(qū)長度為4350bp，比Purdue株的S基因編碼區(qū)長6bp，編碼1449個氨基酸，與Purdue株核苷酸同源性為98.4％；TGEVTS株N基因長度為1149bp，編碼382個氨基酸，與Purdue

5、株核苷酸同源性為98.2％；PEDVQH株M基因長度為681bp，編碼226個氨基酸，與CV777株核苷酸同源性為98.5％。 4)成功構(gòu)建了含TGEVTS株S基因的重組腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV/S、重組腺病毒載體pAd/S和含TGEVTS株S基因的安全、穩(wěn)定的復(fù)制缺陷型重組腺病毒rAd-S。rAd-S毒價高達(dá)1×109TCID50/0.2mL，RT-PCR檢測表明S基因在轉(zhuǎn)錄水平有表達(dá)；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白檢測證實(shí)