豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、本研究旨在建立快速，簡便地檢測豬傳染性胃腸炎病毒的膠體金免疫層析方法。 ⑴利用辛酸-飽和硫酸銨法和親和層析柱聯(lián)合法純化兔抗TGEVN蛋白的多克隆抗體及抗TGEVN蛋白的單克隆抗體。純化后的多抗?jié)舛葹?.692mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，純度為100％。血清抗體效價由2.56×105下降為6.4×104。純化后的單抗?jié)舛葹?.933mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，

2、純度為100％。腹水抗體效價由6.4×104下降為1.6×104。純化后的多抗和單抗可分別用于檢測和標記。 ⑵采用檸檬酸三鈉法制備20nm膠體金，通過肉眼觀察，可見金溶液為酒紅色，透明均勻。通過電鏡掃描觀察到，金顆粒分布均勻，大小均一。紫外掃描觀察到最大吸收峰波長為520nm，峰寬較小，說明膠體金顆粒分布比較均勻。實驗結(jié)果表明所制備的金顆粒可以用于標記單抗。 ⑶用所制的金顆粒標記單克隆抗體，通過實驗確定了穩(wěn)定1ml膠體金

3、所需的最小蛋白用量為0.2mg，最適pn值為7.6。將金標抗體噴涂在玻璃纖維膜上，在試紙條連接的硝酸纖維素膜上固定有抗TGEVN蛋白的多克隆抗體作為檢測線，羊抗鼠IgG的抗體作為質(zhì)控線，在膜的另一端為吸收樣品的吸水紙墊。當被檢測樣品加入樣品墊后，液體便流向免疫膠體金結(jié)合墊，然后流向硝酸纖維素膜并最終流向吸水紙墊。如果樣品中含有豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，膜上便會出現(xiàn)肉眼可見的紅色檢測線，如果樣品中無豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，則

4、不會在膜上顯示可見的紅色線檢測線。 本研究對豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的各項指標進行優(yōu)化，選擇了效果較好的多抗包被液(0.01MpH7.4PBS)，封閉液(0.01MpH7.4PBS含2％BSA)，金標稀釋液(0.01MpH7.4PBS含0.1％BSA，0.5％蔗糖)，硝酸纖維素膜(HF135)，玻璃纖維膜(PR-NJ25)，樣品墊(PR-VL78)和吸收墊(CH-270K)。確定了最佳的封閉條件為室溫封閉10min

5、。并確定了NC膜上多抗的包被濃度為0.0169mg/ml，玻璃纖維膜上金標抗體的噴涂量為0.037mg/ml。探索了膠體金免疫層析檢測豬傳染性胃腸炎病毒的方法，使用試紙條對TCID50為10-5.8的病毒培養(yǎng)液進行檢測，檢測限為100TCID50。經(jīng)測試，試紙條與豬流行性腹瀉病毒，輪狀病毒和豬細小病毒無交叉反應(yīng)，重復(fù)性較好，4℃條件下密封保存90天后仍能有效檢測樣品。此方法最大的優(yōu)點是無需借助檢測儀器，檢測所需試劑都已事先包被在試紙條上