豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株重組N蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TransmissibleGastroenteritisvirusofswine，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TransmissibleGastroenteritisvirusofswine，TGEV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)病仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水，該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以TEGV重組N蛋白為免疫抗原，成功制備了抗TGEV重組N蛋白單克隆抗體，對(duì)TGE的診斷、預(yù)防

2、和控制具有較大的意義。 1、TGEV重組N蛋白的制備、純化與鑒定將豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)N基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-N轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后獲得融合N蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)大小約67KD。大部分重組N蛋白以包涵體形式表達(dá)，采用金屬離子親和層析方法在變形條件下純化。實(shí)驗(yàn)確定以20mM咪唑濃度的PBS緩沖液為雜蛋白的清洗緩沖液，以100mM咪唑濃度的PBS緩沖液為TEGV重組N蛋白的洗脫緩沖液。純化后獲得

3、了高純度的N蛋白，SDS-PAGE觀察為單一清晰的條帶，經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定該蛋白濃度為1500μg/ml。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明重組N蛋白具有與豬傳染性胃腸炎病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)的反應(yīng)原性。 2、抗TGEV重組N蛋白單克隆抗體的制備以純化的TGEV重組N蛋白免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，融合率達(dá)85％(融合率=有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔數(shù)/總細(xì)胞培養(yǎng)孔數(shù))。通過(guò)間接ELISA方法對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，陽(yáng)性

4、率為65％(陽(yáng)性率=陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔數(shù)/有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔數(shù))。陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆后，獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗重組N蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為JY(4)-1、JY(4)-2、JY(4)-3。間接ELISA檢測(cè)3株雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清和免疫小鼠制備的腹水及血清中的抗體效價(jià)均為1:512、1:105、1:105，且單抗與豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸道綜合癥病毒(PRRSV)、豬輪狀病毒(PRV)抗原之